李娟娟 高惠英 張婷婷 尚莉麗 范春雪 康亞亞 羅 靜 李小峰

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的以侵蝕性、對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現的慢性、全身性自身免疫性疾病。 雖然其發(fā)病機制尚不明確,但有研究表明,輔助性T 細胞17(T-helper 17 cell,Th17)和調節(jié)性T 細胞(regulatory T cell,Treg)失衡可能是RA 最直接、最重要的發(fā)病要素。 尤其,Treg細胞減少或功能異常導致免疫耐受缺陷可能是RA發(fā)病的關鍵因素之一[1]。 然而,導致Treg 細胞減少或Treg/Th17 平衡失調的始動因素尚不明確。

TLR7 樣受體(Toll-like receptor 7,TLR7)是一種模式識別受體,可識別相應配體,從而激活TLR 信號通路,導致各種促炎介質的產生[2]。 其可通過調節(jié)Th17 和Treg,而參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[2,3]。 Pin1 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)是一種肽脯氨酰基順反異構酶,其主要作用可介導并上調TLRs 信號的轉導及活性,還可以增強NF-κB 的活性,從而促進疾病的發(fā)展[4]。 既往研究發(fā)現,RA 患者外周血Pin1 過表達,Th17 增高而Treg 降低[5]。 那么,RA 患者外周血中TLR7 表達與Pin1 表達相關性如何,又與Th17/Treg細胞是否具有相關性,尚未見報道。 本研究旨在通過檢測RA 患者外周血TLR7 和Pin1 含量,分析TLR7與Pin1、Th17/Treg、部分細胞因子及疾病活動度的相關性,進一步探索RA 發(fā)病機制。

資料與方法

1.一般資料：選取2020年5月～2021年3月山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科住院部及門診確診的RA 患者92 例作為RA 組,其中男性25 例,患者平均年齡為60 ±8 歲,女性67 例,患者平均年齡為55 ±10 歲。 所有患者符合1987年ACR 修訂的RA 分類標準,并排除其他關節(jié)炎、重疊其他風濕病、有嚴重感染、合并惡性腫瘤及其他嚴重心腦血管疾病者。 RA組又分為初發(fā)組和治療組,其中初發(fā)組46 例(指確診入組時尚未使用藥物),治療組46 例(指確診入組時已使用藥物,包括非甾體抗炎藥、糖皮質激素和DMARDS 藥物,其中糖皮質激素為小劑量醋酸潑尼松每日10mg 及以下,DMARDS 藥物主要有甲氨蝶呤或來氟米特、聯合羥氯喹或短期的生物制劑治療,且治療時間為3 ～6 個月)。 選擇同期筆者醫(yī)院的健康體檢者40 例作為健康對照組。 本研究所有患者均簽署知情同意書,并通過筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批[倫理審批號：(2017)KY 第(004)號]。

2.試劑和檢測方法：TLR7 與Pin1 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。 采用酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunos orbent assay,ELISA)檢測TLR7 與Pin1。 經前臂肘窩處取外周靜脈血5ml 于肝素抗凝管中,顛倒混勻。 血清于1.5ml EP 管中,室溫靜置30min,6000r/min 離心15min 吸取上清液。 嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。 紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C 反應蛋白由山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科完成。 Th17、Treg 及部分細胞因子,由山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科實驗室完成。

3.統計學方法：應用SPSS 25.0 統計學軟件對數據進行統計分析。 符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差(±s)表示,不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(四分位數間距)[M(Q1,Q3)]表示。 組間比較采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。 變量間的相關性檢驗采用Spearman及多元線性回歸分析,以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.TLR7 活性表達在RA 各組和健康對照組的比較：與健康對照組比較,RA 組外周血的TLR7 表達水平明顯高于健康對照組(z=-2.53,P＜0.05);RA初發(fā)組明顯高于健康對照組(P＜0.05),但與治療組比較差異無統計學意義(P＞0.05),詳見圖1。

圖1 TLR7 在RA 各組和健康對照組外周血活性表達

2.RA 組中TLR7 活性表達與病情活動度等指標相關性分析：Spearman相關分析顯示RA 組TLR7 與CRP、受累關節(jié)數、DAS28 評分呈正相關(r=0.255,P＜0.05;r=0.247,P＜0.05;r=0.226,P＜0.05),而與病程、紅細胞沉降率則無明顯相關性 (r=0.007,P＞0.05;r=0.167,P＞0.05),詳見表1。

表1 RA 組臨床指標的統計學描述及TLR7 與其相關性分析

3.Pin1 活性在RA 各組和健康對照組外周血表達的比較：與健康對照組比較,RA 組外周血的Pin1 表達水平明顯高于健康對照組,且差異有統計學意義(z=-6.26,P＜0.001); RA 初發(fā)組、RA 治療組的Pin1 活性表達顯著高于健康對照組(P均＜0.001),但RA 初發(fā)組與RA 治療組間比較,差異無統計學意義(圖2)。

圖2 Pin1 在RA 各組和健康對照組外周血活性表達

4.RA 組外周血中TLR7 活性表達與Pin1 的相關性分析：將RA 組92 例患者測定的TLR7 與Pin1 活性表達量進行Spearman秩相關分析。 結果發(fā)現,TLR7 與Pin1 呈正相關,差異有統計學意義(r=0.206,P＜0.05)。

5.Th17 和Treg 絕對細胞計數在RA 組和健康對照組絕對計數比較：與健康對照組比較,RA 組外周血Th17 細胞計數明顯增高(z=-3.53,P＜0.001),而Treg 細胞計數則顯著降低(z=-4.06,P＜0.001)。 而RA 初發(fā)組和RA 用藥組的Th17 細胞計數和Treg 細胞計數比較差異均無統計學意義(P均＞0.05),詳見圖3。

圖3 RA 組和健康對照組Th17/Treg 比較

6.RA 組外周血中TLR7 活性表達與Th17 和Treg 的相關性分析：Spearman相關分析顯示,RA 組TLR7 與Treg 呈負相關(r=-0.239,P＜0.05),而與Th17 雖有正相關趨勢,但差異無統計學意義(r=0.031,P＞0.05),詳見表2。

表2 RA 組TLR7 表達活性與Th17 和Treg 相關性分析

7.RA 組外周血中TLR7 活性表達與部分細胞因子的相關性分析：Spearman相關分析顯示,RA 組TLR7 與IL-6 呈顯著正相關(r=0.299,P＜0.01),而與IL-10、IL-17、TNF-α 無明顯相關性(表3)。

表3 RA 組TLR7 活性表達與細胞因子相關性分析

8.RA 組TLR7 活性表達與Pin1、疾病活動度、Treg 及部分細胞因子多元線性回歸分析：RA 組TLR7活性表達與Pin1、DAS28 呈顯著正相關(BPin1=0.013,P= 0.028;BDAS28= 0.239,P= 0.035),而與Treg 呈明顯負相關(BTreg=-0.020,P=0.002),詳見表4。

表4 RA 組TLR7 活性表達與Pin1、疾病活動度、Treg 及部分細胞因子多元線性回歸分析

討 論

RA 是一種常見的以慢性滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病,發(fā)病機制復雜,其中,免疫細胞數量或功能紊亂參與該病的發(fā)生、發(fā)展,尤以CD4+T 淋巴細胞最為關鍵。 CD4+T 亞群種類多樣,其中以Treg 細胞較為重要,主要因其可通過產生抗炎性細胞因子,從而具有免疫抑制、維持自身耐受和抑制自身免疫的作用。 Th17 細胞雖與Treg 細胞同源,但作用相反,主要發(fā)揮促炎作用。 此外,Th17 細胞和其他效應性T 細胞的活性也受到Treg 細胞的抑制[6,7]。 因此,維持Th17/Treg 細胞的平衡也是保持機體正常免疫的基礎。

TLR7 激活可導致Treg 細胞的數量減少和功能抑制,而增強自身反應性Th17 應答。 TLR7 還可識別RA 患者血清和關節(jié)液中內源性的單鏈RNA,當其被激活后,通過髓樣細胞分化因子88 經典途徑,引起級聯反應,產生TNF-α、IL-6、干擾素等促炎性細胞因子以及誘導樹突狀細胞和Th17 細胞的分化,從而導致骨破壞和炎性反應[8,9]。 還有研究發(fā)現,TLR7 在RA 滑膜組織中大量表達,活化的TLR7 可獨立誘導STAT-3 信號通路活化核因子-κB 受體活化因子配體(nuclear factor-κB receptor activator ligand,RANKL) 表達, 進而刺激破骨細胞的生成與分化[10,11]。 本研究結果顯示,TLR7 在RA 患者外周血過表達,且與CRP、受累關節(jié)數、DAS28 評分呈顯著正相關。 多元線性回歸分析也進一步證實,RA 患者TLR7 表達與DAS28 評分呈顯著正相關。 Chamberlain 等[12]研究發(fā)現,TLR7 在RA 患者外周血中存在過表達的現象,且與DAS28 評分呈正相關。 這與本研究結果相符。 另外,還有報道,TLR7 在原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome, pSS)、系統性紅斑狼瘡等也過表達,且參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展[13,14]。表明TLR7 過表達是RA 等自身免疫性疾病發(fā)病的關鍵因素之一。

TLR7 和Pin1 可以互相作用,一方面,TLR7 可以激活異構酶Pin1,從而啟動下游級聯反應,誘導干擾素的釋放;另一方面,Pin1 又可上調TLR7 的活性,刺激破骨細胞的活化以及金屬蛋白酶和促炎介質等的產生,從而導致骨破壞和炎性反應[15,16]。 本研究發(fā)現,在RA 患者外周血中,Pin1 活性顯著高于健康對照組,與既往研究結果一致,且Spearman相關分析及多元線性回歸分析均證實Pin1 活性和TLR7 表達呈明顯正相關[4]。 表明Pin1-TLR7 途徑激活可能是RA 發(fā)病的原因之一。

本研究發(fā)現,RA 患者Th17 細胞計數明顯高于健康對照組,而Treg 細胞計數低于健康對照組,與既往研究結果一致,表明Th17 細胞計數增高和Treg 細胞計數減少參與了RA 的進展[1,3,17]。 本研究進一步分析發(fā)現,TLR7 與Treg 呈顯著負相關,而與IL-6 呈顯著正相關,與TNF-α 也有正相關跡象,但差異無統計學意義。 多元線性研究也發(fā)現,TLR7 與Treg 呈顯著負相關,與IL-6 有正相關趨勢,但差異無統計學意義,這可能受多種因素影響,后期可通過動物實驗進一步探索。 雖然Th17 和Treg 功能相互抑制,但二者分化都需要T 淋巴細胞受體和TGF-β,且Th17細胞極化需要額外的IL-6 調節(jié)[11,18]。 Chamberlain等12]研究發(fā)現,TLR 與TNF-α 呈正相關,而且TLR7還可能是TNF-α 反應基因,參與了RA 發(fā)病的慢性病程。 Wang 等[19]還研究發(fā)現,pSS 外周血和唾液腺中TLR7 和炎癥標志物顯著高于健康人,這表明TLR7 信號在局部和全身性疾病中均發(fā)揮重要作用。因此,Pin1-TLR7 途徑激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 發(fā)病的主要原因之一。 本研究發(fā)現,RA 初發(fā)組和RA 用藥組中TLR7、Pin1 活性均明顯高于健康對照組,但在RA 初發(fā)組和RA 用藥組中TLR7、Pin1 活性無明顯差異,這可能與兩組患者均處于疾病活動有關。

綜上所述,RA 患者外周血TLR7 過表達,且與Pin1 過表達、Treg 降低及疾病活動度均相關。 因此,Pin1-TLR7 途徑激活及Treg 降低致免疫耐受缺陷可能是RA 發(fā)病的主要原因之一。 抑制TLR7,或者抑制Pin1-TLR7 信號通路,可能是治療RA 和其他自身免疫性疾病的一種有前途的治療策略。 本研究尚存在一些不足之處。 如有相關文獻報道TLR7 與TNF-α 呈正相關,但在本實驗中雖有正相關趨勢,但差異無統計學意義。 后期筆者將擴大樣本量進一步探索二者的關系,并通過動物實驗,深入研究RA的發(fā)病機制。