陳 立 王 承 郝必烈

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人中最常見和最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤,惡性GBM 患者的預(yù)后極差,5年生存率低于5%[1]。 因此,理解GBM 的分子基礎(chǔ)和發(fā)生過程對于有效治療GBM 具有重要意義。 目前,腫瘤能量代謝異常已逐漸成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 除了葡萄糖和Warburg 效應(yīng)之外,谷氨酰胺(glutamine)代謝上調(diào)也成為多種腫瘤的特征之一[2]。 谷氨酰胺是腫瘤生長所必需的氨基酸,腫瘤細(xì)胞需要異常的谷氨酰胺代謝來促進(jìn)其生長、增殖和存活。 有研究顯示,抑制谷氨酰胺代謝可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力[3]。此外,有研究發(fā)現(xiàn),谷氨酰胺代謝在GBM 中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。 氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)作為苦參的主要生物堿提取物之一,具有抗病毒、抗纖維化、抗炎和抗心律失常等多種藥理作用[5]。 近年來研究表明,OMT 對多種類型的腫瘤具有抑制作用[6]。 然而,OMT 對于GBM 的作用目前還鮮有研究報道。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的遺傳改變發(fā)生在約50%的GBM 患者中。 有研究發(fā)現(xiàn),EGFR 在包括GBM 在內(nèi)的膠質(zhì)瘤的代謝異常中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 由于其磷酸酶活性,EGFR 可以激活Ras 和PI3K 以促進(jìn)Warburg 效應(yīng)和腦腫瘤發(fā)生[7]。 近年來研究發(fā)現(xiàn),EGFR 通過MEK/ERK/ELK1 通路促進(jìn)GBM 中的谷氨酰胺代謝[8]。 此外,OMT 被發(fā)現(xiàn)可以靶向胃癌細(xì)胞中EGFR,從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。 因此,研究OMT 是否可以通過EGFR 調(diào)控GBM 中谷氨酰胺代謝水平,可以為臨床上OMT 治療GBM 提供可靠的理論依據(jù),為改善GBM 的代謝異常提供有潛力的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.細(xì)胞株與主要試劑： 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251(TCHu58)、U87(TCHU138)均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。 一抗p-EGFR(#3777)、EGFR(#4267)和GAPDH(#5274)均購自美國Cell Signaling Technology 公司。 CCK-8 試劑盒(CK04-500)購自日本 Dojindo 同仁化學(xué)研究所。 EdU 試劑盒(C103103)購自廣州銳博生物有限公司。 α-KG(ab83431)、 GSH/GSSG (ab138881)、 谷氨酰胺(A073)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2.細(xì)胞培養(yǎng)： 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)中進(jìn)行培養(yǎng),并置于5% CO2、37℃的加濕培養(yǎng)箱中。

3.CCK-8 檢測細(xì)胞活力： 將細(xì)胞接種至96 孔板(1 × 104個/孔) 中,于37℃下孵育過夜。 經(jīng)過OMT 和(或)EGF 處理后,加入10μl 試劑,于37℃下孵育4h,通過酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞在波長450nm 處的吸光度(A)值,并計算細(xì)胞活力(%) = (細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

4.EdU 檢測細(xì)胞活力： 取對數(shù)期生長細(xì)胞,接種至96 孔板(1 ×105個/孔)中,于37℃下孵育過夜。經(jīng)過OMT 和(或)EGF 處理后,按照說明書通過細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋EdU 試劑,并制備EdU 培養(yǎng)基。 每孔加入100μl 50μmol/L 的EdU 培養(yǎng)基孵育2h,清洗后對細(xì)胞固定化,進(jìn)行染色、觀察。

5.谷氨酰胺代謝標(biāo)志物檢測： 取2 ×106個細(xì)胞在PBS 中勻漿,收集上清液,并通過10kDa Amicon Ultra Centrifugal Filters 去除蛋白質(zhì),按照說明書,檢測流通液中α-KG、GSH/GSSG 的水平。 對于谷氨酰胺的檢測,將細(xì)胞培養(yǎng)在24 孔板中,于37℃下孵育過夜。 收集培養(yǎng)基,按照說明書檢測谷氨酰胺的消耗水平。

6.蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中EGFR 蛋白水平：細(xì)胞經(jīng)過處理后,通過SDS 提取總蛋白,細(xì)胞裂解液在4℃下以10000r/min 離心30min。 測定蛋白濃度后,通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。 5% 脫脂牛奶封閉1h 后,4℃過夜孵育一抗。 洗滌后,孵育辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗,室溫下孵育2h。 通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測待測物表達(dá)情況。

7.統(tǒng)計學(xué)方法： 應(yīng)用Graphpad 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,每個處理重復(fù)3 次,多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.OMT 抑制GBM 細(xì)胞生長：為了研究OMT 在GBM 腫瘤進(jìn)展中的潛在作用,本研究選用了U87 和U251 兩種GBM 細(xì)胞系。 通過CCK-8 檢測不同濃度的OMT 處理12、24、48h 時的細(xì)胞活力(圖1A)。對于兩種細(xì)胞系,當(dāng)OMT 為2mg/ml 時,在48h 后細(xì)胞活力相當(dāng)于未處理細(xì)胞的50%。 結(jié)合EdU 檢測結(jié)果(圖1B)均表明,OMT 以劑量依賴性方式有效抑制GBM 細(xì)胞的生長。

圖1 OMT 抑制GBM 細(xì)胞生長

2.OMT 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝：本研究評估了OMT 對GBM 細(xì)胞谷氨酰胺代謝的作用。 通過2mg/ml 的OMT 處理GBM 細(xì)胞48h,測定了谷氨酰胺重要代謝物α-KG 的水平,結(jié)果顯示,在OMT處理的細(xì)胞中α-KG 水平顯著下降(圖2A)。 此外,谷氨酰胺的副產(chǎn)物GSH/GSSG 在OMT 處理后也被抑制(圖2B),谷氨酰胺消耗(谷氨酰胺向谷氨酸的轉(zhuǎn)化)也下降(圖2C)。 綜上所述,OMT 會抑制GBM細(xì)胞中谷氨酰胺代謝。

圖2 OMT 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝

3.OMT 靶向抑制GBM 細(xì)胞中EGFR 的表達(dá)水平：為了研究OMT 是否通過EGFR 抑制GBM 細(xì)胞的谷氨酰胺代謝,首先測定了OMT 處理后EGFR 的表達(dá)情況。 圖3A 顯示,OMT 處理會顯著抑制p-EGFR蛋白表達(dá)。 因此,為了研究EGFR 對GBM 細(xì)胞的影響,首先通過能夠激活EGFR 通路的配體EGF 來上調(diào)GBM 細(xì)胞中EGFR 的表達(dá)。 結(jié)果顯示,通過50ng/ml 的EGF 處理細(xì)胞15、30、60min 后,細(xì)胞中p-EGFR 表達(dá)隨著EGF 刺激時間的增加而升高(圖3B)。

圖3 OMT 靶向抑制GBM 細(xì)胞中EGFR 的表達(dá)水平

4.EGFR 促進(jìn)GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝：分別在EGF 處理細(xì)胞15、30、60min 后,測定谷氨酰胺代謝標(biāo)志物的水平。 試劑盒檢測結(jié)果顯示,兩種GBM細(xì)胞系種,谷氨酰胺重要代謝物α-KG、谷氨酰胺的副產(chǎn)物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗水平均隨著刺激時間增加而升高(圖4)。 這些結(jié)果說明,EGF 激活的EGFR 會促進(jìn)GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝水平。

圖4 EGFR 促進(jìn)GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝

5.OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝：為了驗證OMT 是通過EGFR 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝,本研究經(jīng)OMT 處理細(xì)胞,并通過EGF 激活EGFR 表達(dá)(圖5A),測定細(xì)胞中谷氨酰胺代謝標(biāo)志物的水平。 結(jié)果顯示,由OMT 處理抑制的α-KG、GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗的水平,能夠被EGF 激活的EGFR 顯著逆轉(zhuǎn)(圖5 中B ～D)。OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝。

圖5 OMT 靶向EGFR 抑制GBM 細(xì)胞中谷氨酰胺代謝

討 論

苦參(Sophorae flavescens)是一種傳統(tǒng)的中草藥,是苦參艾的干燥根。 苦參在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次被記載,用于炎癥、實體瘤等疾病治療。 苦參主要包括生物堿、黃酮類、烷基氧雜蒽酮、醌類、三萜苷、脂肪酸和精油等化學(xué)成分[10]。 其中,氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是苦參的主要生物堿提取物之一,在不同類型的腫瘤中均發(fā)揮抑制作用[11]。 OMT 在不同的腫瘤中靶向調(diào)控的基因是不同的,其發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制也是不同的。 近年來,腫瘤能量代謝的作用受到越來越多的關(guān)注。 既往研究發(fā)現(xiàn),OMT 通過調(diào)節(jié)丙酮酸激酶M2 介導(dǎo)的有氧糖酵解,對結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用[12]。 糖酵解是能量代謝中葡萄糖代謝的一種,癌細(xì)胞以高速率但低效率的方式消耗大量葡萄糖,以提供ATP 并產(chǎn)生乳酸,這也被稱為Warburg 效應(yīng)[13]。 然而OMT 是否會參與谷氨酰胺代謝及其明確的分子機(jī)制尚不完全明確。 本研究發(fā)現(xiàn),OMT 能夠抑制GBM 細(xì)胞的谷氨酰胺代謝過程、抑制細(xì)胞生長。

谷氨酰胺被認(rèn)為是正常生物體中的非必需氨基酸,它對大多數(shù)癌細(xì)胞的快速增殖和生長至關(guān)重要[14]。 腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞膜上大量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收谷氨酰胺,并在谷氨酰胺酶的催化下將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸[15]。 谷氨酸可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或線粒體,作為底物,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, α-KG),維持三羧酸(tricyclic acid, TCA)循環(huán)的穩(wěn)定運(yùn)行,產(chǎn)生ATP,為腫瘤細(xì)胞提供碳源和氮源作為能量,用于維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和脂肪酸合成[16]。 因此,谷氨酰胺代謝被認(rèn)為腫瘤細(xì)胞代謝除Warburg 效應(yīng)之外的另一大特征。 近年來,越來越多的研究證實,針對谷氨酰胺代謝的治療可以有效抑制多種腫瘤的進(jìn)展[17]。

EGFR 是一種屬于酪氨酸激酶受體家族的糖蛋白,與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展以及腫瘤的入侵和轉(zhuǎn)移有著千絲萬縷的聯(lián)系[18,19]。 EGFR 的激活與細(xì)胞增殖、侵襲和GBM 復(fù)發(fā)顯著相關(guān)[20]。 此外,EGFR 在GBM 的代謝異常中起重要作用。 EGFR 誘導(dǎo)的Max選擇性剪接促進(jìn)膠質(zhì)瘤中的葡萄糖代謝和腫瘤生長,抑制EGFR 驅(qū)動的糖酵解誘導(dǎo)GBM 細(xì)胞凋亡[21]。此外,非小細(xì)胞肺癌中,EGFR 突變會引起谷氨酰胺酶的表達(dá)水平升高[22]。 本研究發(fā)現(xiàn),EGFR 能夠促進(jìn)GBM 細(xì)胞中重要代謝物α-KG、谷氨酰胺的副產(chǎn)物GSH/GSSG、谷氨酰胺消耗增多,促進(jìn)谷氨酰胺代謝。并且OMT 會抑制GBM 細(xì)胞中EGFR 的表達(dá)來發(fā)揮谷氨酰胺代謝的抑制作用。

綜上所述,對GBM 細(xì)胞進(jìn)行OMT 治療,能夠顯著抑制GBM 細(xì)胞生長及谷氨酰胺代謝,而OMT 可能通過抑制EGFR 的表達(dá)水平發(fā)揮上述作用。 本研究結(jié)果有助于發(fā)現(xiàn)治療GBM 的新型低分子化合物,并為闡明新的藥效靶點(diǎn)提供一定的藥理學(xué)基礎(chǔ)。