王靜文 魏明慧 孫浩榮 蔣碧輝 薛明明

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是造成我國(guó)居民死亡和疾病負(fù)擔(dān)的首要病因,而血壓升高是CVD 中最常見(jiàn)的潛在危險(xiǎn)因素[1,2]。 壓力超負(fù)荷性心肌肥厚(pressure-overload induced cardiac hypertrophy,POH)是對(duì)高血壓的適應(yīng)性和代償機(jī)制,早期階段心肌細(xì)胞增大、蛋白質(zhì)合成增多、肌節(jié)增長(zhǎng),從而維持心室功能[3～5]。 然而,持續(xù)的壓力超負(fù)荷會(huì)使心臟進(jìn)入失代償階段,并促使心肌細(xì)胞凋亡和纖維化重構(gòu),收縮和舒張功能障礙,最終導(dǎo)致心力衰竭[6]。

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)有兩個(gè)異構(gòu)體,COX-1 介導(dǎo)生理性前列腺素形成,COX-2 存在于炎癥部位,受外界細(xì)胞因子刺激時(shí)大量表達(dá)[7]。 非選擇性COX 抑制劑阿司匹林和特異性COX-2 抑制劑塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制COX-2 實(shí)現(xiàn)解熱、抗炎和鎮(zhèn)痛作用[8,9]。 Notch 信號(hào)通路由Notch 跨膜受體、跨膜配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子組成。 當(dāng)配體與胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí),促進(jìn)NICD 胞內(nèi)釋放和核移位,調(diào)節(jié)下游靶基因Hes1 的表達(dá)[10]。 有研究證實(shí),Notch 信號(hào)通路通過(guò)Notch1 受體調(diào)節(jié)心臟對(duì)壓力的反應(yīng),對(duì)心臟具有保護(hù)作用[11]。

目前關(guān)于阿司匹林和塞來(lái)昔布抗壓力超負(fù)荷性心肌肥厚作用的機(jī)制報(bào)道甚少,本實(shí)驗(yàn)擬探究阿司匹林和塞來(lái)昔布是否通過(guò)Notch1 信號(hào)通路緩解壓力超負(fù)荷介導(dǎo)的心肌肥厚。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株：SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠60只,體質(zhì)量為200 ±20g,由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蒙)2014-0011;大鼠H9c2(2-1)心肌細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。

2.主要試劑與儀器：阿司匹林腸溶片購(gòu)自中國(guó)辰欣藥業(yè)股份有限公司;塞來(lái)昔布膠囊購(gòu)自中國(guó)輝瑞制藥有限公司;乙酰水楊酸購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;塞來(lái)昔布購(gòu)自美國(guó)Biovision 公司;免疫組化試劑盒、Notch1 抗體、Hes1 抗體購(gòu)自北京博奧森有限公司;RNAiso Plus Total RNA 試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;RevertAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó)) 有限公司;SYBR Green PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司;ANP、Hes1蛋白抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;Notch1 蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司。 無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓儀(BP-300A)購(gòu)自中國(guó)四川成都泰盟科技有限公司;超聲心動(dòng)圖檢測(cè)儀(ACUSON SC2000)購(gòu)自德國(guó)Siemens 公司;機(jī)械牽張裝置(Mechano Culture FX2)購(gòu)自美國(guó)Cellscale公司。

3.動(dòng)物模型的制備和分組：大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、模型+阿司匹林組(簡(jiǎn)稱阿司匹林組)和模型+塞來(lái)昔布組(簡(jiǎn)稱塞來(lái)昔布組)。 腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)(abdominal aortic constriction,AAC)以及給藥劑量參考文獻(xiàn)[12],于第8、10、12 周觀察實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

4.無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量：取材前進(jìn)行血壓測(cè)量,記錄平均收縮壓(arterial systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和心率(heart rate,HR)。

5.左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定：稱取體質(zhì)量,取出心臟后預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗殘余血液,濾紙吸干,迅速分離左心室,稱重并計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)。

6.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：取材前行超聲心動(dòng)圖檢測(cè),采集左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左心室舒張末期容積(left ventricular volume at end-diastole,LVEVd)和左心室收縮末期容積(left ventricular volume at end-systole,LVEVs)。

7.免疫組織化學(xué)染色及定量：按免疫組化試劑盒說(shuō)明書步驟操作。 孵育Notch1、Hes1 抗體,400 倍視野下,獲得每張圖像的3 個(gè)隨機(jī)場(chǎng)。

8.qRT-PCR：提取心肌組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR。 各基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。 引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

9.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：H9c2 細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、機(jī)械牽張(mechanical stretch,MS)組、MS + 阿司匹林組、MS +塞來(lái)昔布組、阿司匹林對(duì)照組和塞來(lái)昔布對(duì)照組。 20% 水平牽張力牽張細(xì)胞2h 誘導(dǎo)肥大,藥物干預(yù)濃度分別為2mmol/L 阿司匹林和25μmol/L 塞來(lái)昔布。

10.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：Lipo8000TM介導(dǎo)Notch1 小干擾RNA(siRNA-Notch1)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞接種于彈性硅膠皿中,藥物干預(yù)同上。 轉(zhuǎn)染后分為正常對(duì)照組、MS 組、MS + 阿司匹林組、MS + 阿司匹林+ si-Notch1 組、MS + 塞來(lái)昔布組、MS + 塞來(lái)昔布+ si-Notch1 組、阿司匹林對(duì)照組、塞來(lái)昔布對(duì)照組和si-Notch1 組。

11.Western blot 法檢測(cè)：BCA 法蛋白定量后SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(1 ∶1000 稀釋)和熒光二抗(1∶1000 稀釋),掃描條帶,ImageJ 定量分析灰度值。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 組間比較采用Tukey事后檢驗(yàn)的方差單因素分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.阿司匹林和塞來(lái)昔布可減輕POH 大鼠心臟形態(tài)的變化：模型組LVMI 較假手術(shù)組升高,提示壓力超負(fù)荷性心肌肥厚大鼠造模成功;給藥10、12 周后LVMI 較模型組降低(P均＜0.05,表2)。

表2 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)(n =5,±s)

表2 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)(n =5,±s)

與同時(shí)間假手術(shù)組比較,*P ＜0.05;與同時(shí)間模型組比較,#P ＜0.05

時(shí)間假手術(shù)組模型組阿司匹林組塞來(lái)昔布組8 周3.72 ±0.06 4.44 ±0.18* 4.22 ±0.194.29 ±0.14 10 周 3.84 ±0.16 4.64 ±0.10* 4.09 ±0.07# 4.21 ±0.07#12 周 3.55 ±0.06 4.69 ±0.09* 3.85 ±0.21# 3.99 ±0.07#

2.阿司匹林和塞來(lái)昔布可抑制POH 大鼠心臟功能的下降和動(dòng)脈血壓升高：M 型超聲心動(dòng)圖的代表性圖像(圖1)。 模型組LVEF 和LVFS 較假手術(shù)組降低,LVIDd、LVIDs、LVEVd、LVEVs 較假手術(shù)組升高,給藥10、12 周后LVEF、LVFS 較模型組升高,LVIDd、LVIDs、LVEVd、LVEVs 較模型組降低(P均＜0.05,圖2)。 取材前測(cè)量動(dòng)脈血壓,模型組SBP、DBP、HR 較假手術(shù)組升高,給藥后這些參數(shù)趨于正常(P均＜0.05,表3)。

表3 各組大鼠的血壓參數(shù)(±s,n =5)

表3 各組大鼠的血壓參數(shù)(±s,n =5)

與同時(shí)間假手術(shù)組比較,*P ＜0.05;與同時(shí)間模型組比較,#P ＜0.05

時(shí)間組別SBP(mmHg)DBP(mmHg)HR(次/分)假手術(shù)組92.29±3.1176.95±7.11293.20±19.16 8 周模型組119.03±4.96* 100.51±2.90* 399.80±16.76*阿司匹林組 105.17±4.96#86.57±5.41# 319.40±28.86#塞來(lái)昔布組 102.84±5.69#85.26±8.23# 310.40±27.58#10 周假手術(shù)組93.01±8.5481.90±4.76301.20±27.13模型組135.17±12.28* 107.90±10.93* 397.60±11.11*阿司匹林組 103.42±4.25#85.77±5.91# 306.00±11.75#塞來(lái)昔布組 104.29±6.05#87.68±7.39# 318.40±22.69#12 周假手術(shù)組94.80±8.0178.94±6.42307.00±21.99模型組144.37±11.14* 118.31±7.28* 405.40±18.77*阿司匹林組93.58±5.51#79.18±6.88# 310.40±11.96#塞來(lái)昔布組 100.33±7.85#83.97±9.30# 306.40±10.93#

圖1 M 型超聲心動(dòng)圖的代表性圖像(實(shí)線箭頭所示為L(zhǎng)VIDd,虛線箭頭所示為L(zhǎng)VIDs)

圖2 各組大鼠M 型超聲檢測(cè)結(jié)果(n =5,±s,*P ＜0.05)

3.阿司匹林和塞來(lái)昔布上調(diào)POH 大鼠的Notch1信號(hào)通路：免疫組化染色結(jié)果顯示,模型組Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組降低,給藥后Hes1 蛋白較模型組表達(dá)升高,阿司匹林組(10、12 周)和塞來(lái)昔布組(12 周)Notch1 蛋白較模型組表達(dá)升高(P均＜0.05,圖3 中A 和B)。 qRT-PCR 結(jié)果顯示,模型組Notch1 和Hes1mRNA 表達(dá)較假手術(shù)組降低,給藥后Notch1 和Hes1mRNA 較模型組表達(dá)升高(P均＜0.05,圖3 中C 和D)。

圖3 阿司匹林和塞來(lái)昔布對(duì)Notch1 信號(hào)通路的影響

4.阿司匹林和塞來(lái)昔布通過(guò)上調(diào)Notch1 信號(hào)通路緩解MS 誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大：藥物干預(yù)MS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞48h 可降低ANP 蛋白的表達(dá)(P均＜0.05,圖4)。 MS 組Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組降低,藥物干預(yù)后Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)較MS 組增加(P均＜0.05,圖5)。

圖4 Western blot 法檢測(cè)阿司匹林和塞來(lái)昔布干預(yù)時(shí)間

圖5 Western blot 法檢測(cè)阿司匹林和塞來(lái)昔布對(duì)Notch1 信號(hào)通路的影響

5.敲低Notch1 的表達(dá)抑制了阿司匹林和塞來(lái)昔布對(duì)MS 誘導(dǎo)細(xì)胞肥大的保護(hù)作用以及對(duì)Notch1信號(hào)通路的影響：與MS +阿司匹林組比較,MS + 阿司匹林+si-Notch1 組ANP 蛋白顯著升高,塞來(lái)昔布亦如此(P均＜0.05,圖6A);與MS + 阿司匹林組比較,MS + 阿司匹林+ si-Notch1 組Notch1、Hes1 蛋白顯著降低,塞來(lái)昔布亦如此(P均＜0.05,圖6 中B 和C)。

圖6 Western blot 法檢測(cè)敲低Notch1 后對(duì)ANP 蛋白和Notch1 信號(hào)通路的影響

討 論

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)共同揭示了阿司匹林和塞來(lái)昔布抗壓力超負(fù)荷性心肌肥厚的分子機(jī)制。 阿司匹林和塞來(lái)昔布顯著減輕了AAC 誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚和MS 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞肥大。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明阿司匹林和塞來(lái)昔布上調(diào)了Notch1 及其下游靶基因Hes1 的表達(dá)。 敲低Notch1的表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了阿司匹林和塞來(lái)昔布抗心肌肥厚的作用以及其對(duì)Notch1 信號(hào)通路的調(diào)控。

壓力超負(fù)荷性心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制盡管還沒(méi)有完全明確,但主要由于高血壓所造成的血液壓力超負(fù)荷,從而促使心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、肌節(jié)數(shù)量以及單個(gè)心肌細(xì)胞體積的增加[13]。 壓力超負(fù)荷性心肌肥厚隨著時(shí)間的推移,往往伴隨著心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變,本研究采用8、10 和12 周3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。

M 型超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)大鼠心功能,AAC 可誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚和左心功能下降,具體表現(xiàn)為舒張末期和收縮末期LVID、LVEV 升高以及LVEF、LVFS 下降。 給藥10 和12 周后上述現(xiàn)象可被緩解,因此阿司匹林和塞來(lái)昔布可改善AAC 誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚和左心功能下降。 動(dòng)脈血壓與LVMI 測(cè)定結(jié)果也同樣證實(shí)了這一點(diǎn),且肥厚心肌形態(tài)的改變要早于結(jié)構(gòu)和功能的改變。

既往研究表明,機(jī)械牽張引發(fā)的壓力超負(fù)荷會(huì)促進(jìn)炎性反應(yīng)導(dǎo)致心肌肥厚[14]。 Notch1 作為機(jī)械壓力感受性蛋白,它的激活可保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷,反之加劇心肌肥厚和纖維化[15]。 為了進(jìn)一步探究Notch1 信號(hào)通路以及其是否在阿司匹林和塞來(lái)昔布的抗心肌肥厚過(guò)程中起關(guān)鍵作用,本實(shí)驗(yàn)于藥物處理前后對(duì)Notch1 信號(hào)通路表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),并通過(guò)轉(zhuǎn)染小干擾RNA 敲低Notch1 表達(dá)。 結(jié)果表明,在AAC 誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠和MS 誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞中Notch1、Hes1 表達(dá)下調(diào),阿司匹林和塞來(lái)昔布能夠部分恢復(fù)Notch1 信號(hào)通路,而敲低Notch1 后其通路被阻斷,心肌肥厚標(biāo)志物ANP 的表達(dá)顯著上調(diào),反向驗(yàn)證了阿司匹林和塞來(lái)昔布對(duì)心肌肥厚的抑制可能是通過(guò)上調(diào)Notch1 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,阿司匹林和塞來(lái)昔布通過(guò)激活Notch1信號(hào)通路對(duì)壓力超負(fù)荷性心肌肥厚發(fā)揮保護(hù)作用。 在未來(lái)研究中,環(huán)氧化酶抑制劑對(duì)機(jī)械壓力感受性蛋白Notch1 表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。