李 朔，李 瀟，張曉黎，吳興壯*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種重要的非蛋白氨基酸，主要是通過谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）轉(zhuǎn)化谷氨酸合成[1]，廣泛分布于自然界中。經(jīng)科學(xué)研究證實，GABA作為交感神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一[2]，不僅具有降低神經(jīng)元活力、避免神經(jīng)細胞過熱[3]和降血壓的作用[4]，還可提高血漿生長激素濃度、腦蛋白合成速率以及抑制小氣道源性肺腺癌等功效[5-6]。鑒于GABA在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域中具有重要用途，隨著“健康中國”上升為國家戰(zhàn)略，功能食品行業(yè)正在進入一個黃金發(fā)展期。近年來，為了實現(xiàn)GABA的有益功能，人們將其作為生物活性因子已開發(fā)出富含GABA的奶制品[7]、調(diào)味品[8]、發(fā)酵腌制品[9]等眾多功能性食品，展現(xiàn)出了廣闊的發(fā)展前景。

由于GABA在生物組織中濃度很低，所以很難從自然生物中充分提取，且通過化學(xué)合成的GABA定向添加到食品中被認為是不自然和不安全的[10]。因此有必要尋找一種以自然和成本效益的方式生產(chǎn)和增加食品中的GABA。乳酸菌被公認為安全級（generally regarded as safe，GRAS）微生物，且被證實存在谷氨酸脫羧酶活性，具有轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的能力[11]，已受到國內(nèi)外研究者的重點關(guān)注。周青[12]研究表明，在優(yōu)化碳氮源及添加量的條件下，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）WZ011能產(chǎn)生1.261 g/L的GABA。SHAN Y等[13]從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中成功篩選出一株高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017并將其應(yīng)用到酸奶發(fā)酵劑中發(fā)酵酸奶，結(jié)果顯示不僅提高了酸奶中GABA的含量，同時制備的酸奶和對照酸奶在風(fēng)味和質(zhì)地沒有顯著性差異。林楊等[14]從吉爾吉斯斯坦地區(qū)特色乳制品中分離出一株戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）Z6，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝成功研制出了富含GABA和豐富營養(yǎng)物的乳酸菌發(fā)酵飲料。KWON S Y等[15]以水芹菜為主要原料，采用腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）復(fù)合發(fā)酵，并通過優(yōu)化增加了水芹中GABA的含量，成功生產(chǎn)了這種同時富含葡聚糖和GABA的新型功能性水芹。

本課題組前期在東北酸菜中成功篩選并鑒定了一株產(chǎn)GABA的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LAG-1003，本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計，進一步對其培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化，旨在提高菌株LAG-1003產(chǎn)GABA能力，為今后GABA商業(yè)化生產(chǎn)以及制備富含GABA的功能性食品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LAG-1003：分離篩選自東北酸菜，現(xiàn)保藏于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所。

1.1.2 化學(xué)試劑

體積分數(shù)為95%乙醇、次氯酸鈉、苯酚、硼砂、硼酸（均為分析純）：沈陽百盛化工有限公司；谷氨酸鈉、小米糠（均為食品級）：購于農(nóng)科院市場；γ-氨基丁酸標準品（純度99.9%）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司。

胰蛋白胨酵母膏葡萄糖鹽（trypticase yeast extract glucose salt，TYG）培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人單面工作凈化臺、DGL-35X立式高壓滅菌鍋：上海力辰儀器科技有限公司；CJ50-3疊加式培養(yǎng)箱、TG16-WS臺式高速離心機：無錫瑪瑞特科技有限公司；756PC型紫外可見分光光度計：上海堪鑫儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株LAG-1003活化及種子液的制備

將4 ℃穿刺保藏的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LAG-1003菌株接種于25 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于33 ℃恒溫活化培養(yǎng)24 h，后將活化后的菌株按5%的接種量轉(zhuǎn)接至25 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于33 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，得到種子液。

1.3.2 菌株LAG-1003發(fā)酵液的制備

將培養(yǎng)24 h的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LAG-1003按照5%的接種量，接種于含有10 g/L谷氨酸鈉的TYG發(fā)酵培養(yǎng)基中，在33 ℃條件下，培養(yǎng)48 h，即得菌株LAG-1003發(fā)酵液。

1.3.3 分析檢測

（1）菌體生物量

菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中，以空白培養(yǎng)基作為對照，采用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測量48 h培養(yǎng)液（OD600nm值）。

（2）γ-氨基丁酸含量的測定

采用Berthelot比色法對發(fā)酵液中的GABA含量進行測定[16-17]。分別配制質(zhì)量濃度0、0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L的GABA標準溶液，并稀釋5倍。以不加標準溶液為對照，取稀釋后不同質(zhì)量濃度的標準液0.5 mL，依次加入0.1 mL碳酸鈉溶液（1.0 mol/L）、pH 9硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L）0.5 mL、6%苯酚1 mL，混勻后放入冰浴中添加5.25%（有效氯）次氯酸鈉溶液0.4 mL，待溫度恢復(fù)到室溫并保持6 min后放入沸水中對混合物加熱10 min，隨即在冰浴中冷卻9 min，待出現(xiàn)藍綠色后向混合物中加入2 mL體積分數(shù)為60%乙醇，并在630 nm波長下測定其光密度值（OD630mm值），并做三組重復(fù)樣。以測定的OD630mm值（y）為縱坐標，GABA標準溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。按照γ-氨基丁酸標準曲線回歸方程（y=1.339 3x-0.008 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9）計算發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量。

1.3.4 培養(yǎng)基組成優(yōu)化單因素試驗

以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行單因素試驗，以1%的丁二酸鈉、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉作為唯一碳源，在確定碳源的基礎(chǔ)上，固定碳源總量為1%，選取葡萄糖和丁二酸鈉按照4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例進行復(fù)配；再以1%的牛肉浸粉、蛋白胨、小米糠、胰蛋白胨、酵母膏作為唯一氮源或復(fù)配氮源（1∶1），酵母膏＋牛肉浸粉、酵母膏＋小米糠、酵母膏＋蛋白胨、酵母膏＋胰蛋白胨；選擇總碳氮量范圍為（1%～7%）、碳氮比例為1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶4、1∶5；分別添加5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L的谷氨酸鈉。分別探究培養(yǎng)基成分對菌株LAG-1003 GABA產(chǎn)量以及生物量（OD600nm值）的影響。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗篩選的結(jié)果，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以GABA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，選擇復(fù)合碳源添加量（A）、復(fù)合氮源添加量（B）、谷氨酸鈉添加量（C）為試驗的自變量因素，對菌株LAG-1003發(fā)酵產(chǎn)GABA的培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin 2021 軟件進行圖形繪制和IBM SPSS Statistics 26 進行單因素方差分析最小顯著差異（least significant difference，LSD）t檢驗，每次試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 碳源種類對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

為得到菌株LAG-1003最適發(fā)酵產(chǎn)GABA的單一碳源，試驗以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將添加量為1%的丁二酸鈉、葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖分別添加到培養(yǎng)基中，探究6種不同碳源對LAG-1003菌株生長及合成GABA能力的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，最佳碳源為葡萄糖時菌株生物合成GABA產(chǎn)量最高（2.47±0.06）g/L，且生長較好，與其他碳源的GABA產(chǎn)量均存在顯著性差異（P＜0.05）。果糖、蔗糖、可溶性淀粉雖然對菌株生長較好，但菌株生物合成GABA能力卻較弱。同時觀察到丁二酸鈉作為單一碳源時，雖然菌株生長相對較差，但對菌株發(fā)酵合成GABA能力卻相對較強，推測其對菌株催化底物向GABA轉(zhuǎn)化過程中能夠提高谷氨酸脫羧酶活性。此外，乳糖和麥芽糖雖然GABA含量相對較高，但考慮到使用麥芽糖、乳糖成本會較高。因此，選擇葡萄糖與丁二酸鈉作為最適碳源。

圖1 碳源種類對菌株LAG-1003生物量及γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source types on biomass and GABA production of strain LAG-1003

2.1.2 復(fù)合碳源比例對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

為選出最優(yōu)復(fù)合碳源比例，以TYG培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定碳源總量為1%，將葡萄糖與丁二酸鈉按照4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶4、1∶3、1∶2比例進行復(fù)配，同時將單一碳源丁二酸鈉和葡萄糖分別作為對照組進行比對，探究復(fù)合碳源對LAG-1003菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA和生物量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當葡萄糖與丁二酸鈉的比例為3∶1時，菌株生物量及GABA合成量均較高，分別達到0.698±0.02、（2.60±0.02）g/L，與其他各組比例存在顯著性差異（P＜0.05），且與丁二酸鈉、葡萄糖作為單一碳源時相比均存在差異顯著（P＜0.05）。隨著丁二酸鈉所占得比例增加，菌株生物量和發(fā)酵液中的GABA產(chǎn)量均較低，源于丁二酸鈉作為有機碳源雖然能夠提高GAD的活性增加GABA的產(chǎn)量，同時作為一種有機酸，其含量過多的積累會導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降[18]，從而不利于菌株生長和GABA含量增加。因此，選擇葡萄糖與丁二酸鈉比例為3∶1。

圖2 葡萄糖與丁二酸鈉比例對菌株LAG-1003生物量及γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glucose and sodium succinate ratio on biomass and GABA production of strain LAG-1003

2.1.3 氮源種類對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

為得到菌株LAG-1003最適發(fā)酵產(chǎn)GABA的單一氮源，試驗以TYG發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將胰蛋白胨、牛肉浸粉、酵母膏、小米糠、蛋白胨分別按照1%的量添加到培養(yǎng)基中，探究5種不同氮源對LAG-1003菌株生長及轉(zhuǎn)化GABA能力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 氮源種類對菌株LAG-1003生物量及γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on biomass and GABA production of strain LAG-1003

由圖3可知，當選擇酵母膏作為唯一氮源時，菌株生物量及GABA產(chǎn)量分別達到0.818±0.03、（2.79±0.03）g/L與其他組均存在差異性顯著（P＜0.05）。黃桂東等[19]研究表明，酵母膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源時，對菌株生長及GABA合成能力遠高于其他氮源，本試驗結(jié)果與此結(jié)論相符。有研究表明，復(fù)合氮源對菌株生長及GAD活性具有促進作用[20]，本試驗在酵母膏作為氮源的基礎(chǔ)上，復(fù)配其他氮源組成復(fù)合氮源進行下一步的研究。

2.1.4 復(fù)合氮源對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

以最佳氮源為基礎(chǔ)，固定氮源總量為1%，將酵母膏與蛋白胨、胰蛋白胨、小米糠、牛肉浸粉分別按照1∶1的比例進行復(fù)配，同時將單一氮源酵母膏作為對照組進行比對，探究復(fù)合氮源對LAG-1003菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA和生物量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，采用酵母膏與小米糠以1∶1復(fù)配時菌體生物量及GABA產(chǎn)量分別達到0.924±0.05、（2.99±0.02）g/L，均高于酵母膏作為唯一氮源的情況，并顯著高于其他各組（P＜0.05）。推測，酵母膏含有必需的生長因子能夠促進菌體生長代謝，同時小米糠又被稱為“天賜營養(yǎng)源”[21]，兩者共同促進菌體GABA的生物合成。此外也有研究表明小米糠本身含有谷氨酸脫羧酶，能夠促進菌株本身的GAD活性，從而增加GABA的產(chǎn)量[22]。高愛同[23]將廉價小米糠作為培養(yǎng)基，在只加入合成底物的情況下，菌株依然能夠產(chǎn)生較高的GABA。因此，酵母膏與小米糠最適復(fù)配比例為1∶1。

圖4 復(fù)合氮源對菌株LAG-1003生物量及γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of compound nitrogen source on biomass and GABA production of strain LAG-1003

2.1.5 碳氮總量及比例對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

為選擇最優(yōu)碳氮總量及比例，選取碳氮總量范圍為1%～7%，比例為1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶4、1∶5進行培養(yǎng)基優(yōu)化，試驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，在不同的碳氮比下，菌體生物量及GABA產(chǎn)量隨培養(yǎng)基碳氮總量的變化呈先增加后減少的趨勢。這是因為碳氮總量的增加會明顯提高菌株的生長及GABA產(chǎn)量，但碳氮總量太大會抑制菌株生長和GAD活性。在碳氮比例為1∶1、碳氮總量為5%時，菌體生物量及GABA產(chǎn)量均出現(xiàn)峰值，分別為1.35±0.04、（4.61±0.02）g/L。綜合考慮，選取最適碳氮總量為5%、最適碳氮比例為1∶1。

圖5 碳氮總量及總碳氮比對菌株LAG-1003生物量（A）及γ-氨基丁酸產(chǎn)量（B）的影響Fig.5 Effect of contents and total carbon and nitrogen ratio on biomass (A) and GABA production (B) of strain LAG-1003

2.1.6 谷氨酸鈉添加量對菌株LAG-1003發(fā)酵的影響

谷氨酸鈉是使用具有GABA能力的菌株來生產(chǎn)GABA的主要合成底物，其添加量能夠控制GAD的活性，進而影響GABA合成量[24]。在TYG培養(yǎng)基中添加5～25 g/L的谷氨酸鈉，探究其對菌體生長及GABA合成的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 谷氨酸鈉添加量對菌株LAG-1003生物量及γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of monosodium glutamate addition on biomass and GABA production of strain LAG-1003

由圖6可知，當谷氨酸鈉添加量為5～15 g/L時，菌體生物量及GABA產(chǎn)量隨谷氨酸鈉添加量增加而增高；當谷氨酸鈉添加量為15 g/L時，菌株利用底物生物轉(zhuǎn)化GABA產(chǎn)量最高，為（5.661±0.05）g/L，且菌體生長情況最好，OD600nm值為1.142±0.03；隨著谷氨酸鈉添加量在15～25 g/L的增加不能有效的增加GABA合成以及促進菌體的生長，表明該菌株不能耐受高濃度的谷氨酸鈉，這是因為高濃度的底物會增加細胞滲透壓，干擾細菌代謝，影響GAD的活性[25]。因此，最適谷氨酸鈉添加量為15 g/L。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合碳源（葡萄糖與丁二酸鈉比例為3∶1）添加量（A）、復(fù)合氮源（酵母膏與小米糠的比例為1∶1）添加量（B）、谷氨酸鈉添加量（C）為自變量，以GABA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值（Y），Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

據(jù)表2的試驗結(jié)果，通過Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行二次回歸擬合，得到各個因素對菌株LAG-1003發(fā)酵產(chǎn)GABA的二次回歸方程如下：

由表3可知，回歸方程模型項P=0.000 1＜0.05，失擬項P=0.050 2＞0.05，表明建立的二次的回歸模型極顯著且符合實際。該模型的決定系數(shù)R2為0.973 4，表明響應(yīng)值的變化能夠以97.34%用該模型解釋，校正決定系數(shù)R2adj=0.939 2，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）3.49%，進一步說明了模型的預(yù)測值與實際值擬合程度較好。由P值可知，影響因子一次項A、B，二次項A2、B2、C2對GABA的產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），交互項AC、一次項C對GABA產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）。其他項均不顯著。由F值可知，可以確定三者對GABA產(chǎn)量影響順序為復(fù)合碳源添加量＞復(fù)合氮源添加量＞谷氨酸鈉添加量。

通過軟件Design-Expert 8.0.6對回歸方程進行分析，得各因素交互作用對結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見圖7。由圖7可知，AC響應(yīng)面較陡峭，等高線越接近于橢圓形，說明AC交互項對結(jié)果影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖7 復(fù)合碳源、復(fù)合氮源及谷氨酸鈉添加量對γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between compound carbon source,compound nitrogen source and monosodium glutamate addition on GABA production

通過軟件Design-Expert V8.0.6對回歸方程進行求解，得到最佳培養(yǎng)基組分為復(fù)合碳源（葡萄糖與丁二酸鈉比例為3∶1）添加量25.81 g/L、復(fù)合氮源（酵母膏與小米糠比例為1∶1）添加量25.70 g/L、谷氨酸鈉添加量15.64 g/L，在此條件下，GABA產(chǎn)量理論值為6.14 g/L。為了便于實際操作，將最佳培養(yǎng)基組分修正為復(fù)合碳源添加量26 g/L、復(fù)合氮源添加量26 g/L、谷氨酸鈉添加量16 g/L，在此優(yōu)化條件下進行6組平行驗證試驗，得到菌株LAG-1003的GABA產(chǎn)量實際值為6.15 g/L，與預(yù)測值相近，證明了用響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基組分合理可靠。

3 結(jié)論

本研究通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化了植物乳桿菌利用谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉生成GABA的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明，植物乳桿菌LAG-1003產(chǎn)GABA的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為復(fù)合碳源添加量26 g/L、復(fù)合氮源添加量26 g/L、谷氨酸鈉添加量16 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，33 ℃靜置培養(yǎng)48 h，GABA產(chǎn)量為6.152 g/L，是優(yōu)化前的2.91倍。