胡楠楠，亓偉華，尤麗新，秦鳳賢*

（1.長春科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130600；2.吉林省功能性食品產(chǎn)業(yè)工程研究中心，吉林 長春 130600）

玉米須（Stigma maydis）是玉米的花柱和柱頭，大部分的玉米須通過燒掉或廢棄扔掉等方式進(jìn)行處理，不僅造成了極大的環(huán)境污染，同時(shí)也帶來了有效資源的浪費(fèi)[1]。玉米須中含有很多生理活性物質(zhì)，包括黃酮類化合物[2-3]、花青素[4]、多糖[5-6]、甾醇[7]等。玉米須多糖具有保護(hù)腸道[8]、抗氧化[9]、降血糖[10-11]、抗腫瘤[12]等生理功能。

目前，關(guān)于玉米須多糖的提取方法研究較多，有化學(xué)法[13-14]、物理法[15-16]、物理或化學(xué)輔助生物酶法[17]。而生物發(fā)酵法制備玉米須多糖目前鮮見報(bào)道，生物發(fā)酵法是利用菌株發(fā)酵產(chǎn)生的淀粉酶、蛋白酶等水解原料中淀粉、蛋白質(zhì)為微生物的生長代謝提供碳源和氮源，同時(shí)生成纖維素酶等代謝產(chǎn)物，得到多糖。食用菌是公認(rèn)的安全菌株，食用菌生長過程中可生成淀粉酶，蛋白酶等多種酶系。淀粉酶和蛋白酶利用原料中的淀粉和蛋白質(zhì)，為微生物的生長繁殖提營養(yǎng)物質(zhì)，提高了原料的利用率。同時(shí)，它使得微生物產(chǎn)酶與酶解過程合二為一，省去了酶解反應(yīng)過程中的分離純化過程[18]。由于食用真菌“藥食同源”的特點(diǎn)，利用食用真菌發(fā)酵制備多糖已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。董玉瑋等[19]利用固體發(fā)酵靈芝產(chǎn)多糖，得到多糖含量為24.85 mg/g。HU W等[20]對(duì)猴頭菇發(fā)酵菌絲體的多糖進(jìn)行純化。

本研究玉米須為原料，以黑木耳（Auricularia auricula）為菌株，采用液體發(fā)酵制備玉米須多糖，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，并考察玉米須多糖清除羥基自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力，為提高玉米須資源的附加值，為其深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原材料

黑木耳（Auricularia auricula）、馬鈴薯、玉米須（自然晾干，粉碎，過100目）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、酵母粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，維生素B1（vitamin B1，VB1）、維生素C（vitamin C，VC）、乙醇、氯化亞鐵、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、濃硫酸、檸檬酸、氫氧化鈉（均為分析純）：北京化工廠；溴化鉀（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH（分析純）：上海瑞永生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切塊，加水煮沸30 min，過濾，濾液中添加15 g葡萄糖，充分溶解后過濾，加水定容至1 L，分裝，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：取10 g粉碎玉米須置于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為6.0，50 ℃保溫2 h，添加30 g葡萄糖、4 g酵母粉、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O和0.1 g VB1。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MLS-37型高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；HZQ全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BCN-1360凈化工作臺(tái)：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Cary 300 scan紫外可見分光光度計(jì)：美國瓦里安VARIAN公司；VERTEX70傅里葉紅外光譜儀：德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米須粗多糖的制備

母種培養(yǎng)液的制備：向裝液量為50 mL/250 mL的菌種培養(yǎng)基中接種質(zhì)量為1 g的菌株，在溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min條件下培養(yǎng)5 d，得到母種培養(yǎng)液。

發(fā)酵液的制備：在裝液量為60 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種一定量的母種培養(yǎng)液，在設(shè)定的溫度下、搖床轉(zhuǎn)速100 r/min培養(yǎng)一定的時(shí)間。

玉米須粗多糖的制備：將發(fā)酵液凍干，得到玉米須粗多糖。

1.3.2 分析檢測(cè)

（1）發(fā)酵液中多糖含量測(cè)定[21]

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL及0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，各試管用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。加入0.5 mL 6%的苯酚溶液和2.5 mL的濃硫酸后振蕩混勻，靜置冷卻30 mL，以蒸餾水1 mL同等操作為空白對(duì)照，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y=0.024 7x+0.018 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 7。

將發(fā)酵液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行處理。于波長490nm處測(cè)定吸光度值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算多糖含量。

（2）發(fā)酵液中纖維素酶活性測(cè)定[22]

纖維素酶可以水解玉米須中的纖維素，有利于多糖的溶出，因此纖維素酶活也是一個(gè)重要指標(biāo)。

取50 mg濾紙，剪碎后加至4.0 mL 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 5.0）中，加熱至50 ℃；添加1 mL發(fā)酵液于混合物中，50 ℃水浴保持2 h，采用加熱法終止酶反應(yīng)（95 ℃、10 min）；冷卻后用DNS比色法測(cè)定酶解液中還原糖增加量。纖維素酶酶活定義：1 mL粗酶液單位時(shí)間（1 min）內(nèi)50 ℃水解濾紙產(chǎn)生l μmol葡萄糖定義為一個(gè)酶活單位（U/mL）。

纖維素酶酶活計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣纖維素酶的活性，U/g；m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程上計(jì)算得到的的葡萄糖的質(zhì)量，mg；M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，180.2 g/mol；t為酶解反應(yīng)時(shí)間，min；1 000為單位換算因子，1 mmol=1 000 μmol；n為稀釋倍數(shù)。

（3）粗多糖紅外光譜分析[19]

取2 mg凍干后的玉米須粗多糖樣品，加入200 mg kBr充分研磨后，進(jìn)行壓片，在波數(shù)400～4 000 cm-1范圍內(nèi)用紅外光譜儀進(jìn)行掃描。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以接種量7%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，分別單獨(dú)考察接種量（3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（2 d、4 d、6 d、8 d和10 d）對(duì)發(fā)酵液中多糖含量和纖維素酶活的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

利在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液中多糖含量（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 玉米須粗多糖的抗氧化活性測(cè)定

（1）對(duì)·OH的清除作用

于10mL具塞試管中依次加入2mL質(zhì)量濃度為1mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的樣品溶液、0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L FeCl2溶液、6.5 mL去離子水和0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，混合均勻，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后以蒸餾水調(diào)零，在波長510 nm處測(cè)吸光度值，以VC作為陽性對(duì)照[23]?！H的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為樣品溶液的吸光度值；A2為去離子水代替FeCl2的吸光度值；A3為去離子水代替樣品溶液的吸光度值。

（2）對(duì)DPPH·的清除作用

于試管中加入2 mL質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL的樣品溶液和2 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液（以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇配制），混勻后，室溫下避光反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后在波長517 nm處測(cè)定吸光度值。以VC作為為陽性對(duì)照。DPPH·的清除率計(jì)算公式如下[24]：

式中：A1為樣品溶液的吸光度值；A2為體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替DPPH溶液的吸光度值；A3為去離子水代替樣品溶液的吸光度值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須多糖發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響

對(duì)黑木耳進(jìn)行母種培養(yǎng)后，在裝液量為60 mL/250 mL的三角瓶中分別接種3%、5%、7%、9%和11%的母種培養(yǎng)液，25 ℃搖床培養(yǎng)（100 r/min）6 d，測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量和纖維素酶活的結(jié)果見圖1。

圖1 接種量對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響Fig.1 Effect of inoculum on polysaccharide content and cellulase activity

由圖1可知，隨著接種量在3%～11%范圍內(nèi)的增加，多糖的含量和纖維素酶活均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為3%～7%時(shí)，多糖含量和纖維素酶活均隨之升高；當(dāng)接種量為7%時(shí)，糖含量和纖維素酶活分別為12.2 mg/L和117.5 U/L，均達(dá)最大值；當(dāng)接種量＞7%之后，多糖含量和纖維素酶活有所下降。這可能是由于當(dāng)接種量增加到一定程度時(shí)，可以利用的玉米須發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)有限，不利于發(fā)酵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[25]。因此，選擇最佳接種量為7%。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響

溫度是影響微生物生長、代謝產(chǎn)物積累的主要因素之一，而且，溫度還會(huì)影響酶的活性，影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，最終影響代謝產(chǎn)物的合成。對(duì)黑木耳進(jìn)行母種培養(yǎng)后，在裝液量為60 mL/250 mL的三角瓶中接種7%的母種培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度分別為15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)（100 r/min）6 d，測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量和纖維素酶活的結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on polysaccharide content and cellulase activity

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度在15～35 ℃范圍內(nèi)的升高，多糖的含量和纖維素酶活均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度為15～25 ℃時(shí)，多糖含量和纖維素酶活均隨之升高；當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，多糖含量和纖維素酶最高，分別為12.52 mg/L和126.4 U/L；當(dāng)發(fā)酵溫度高于25 ℃之后，多糖含量和纖維素酶活有所下降。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為25 ℃。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響

對(duì)黑木耳進(jìn)行母種培養(yǎng)后，在裝液量為60 mL/250 mL的三角瓶中接種7%的母種培養(yǎng)液，在溫度為25 ℃的條件下?lián)u床（100 r/min）分別培養(yǎng)2 d、4 d、6 d、8 d和10 d，測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量和纖維素酶活的結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖含量和纖維素酶活的影響Fig.3 Effects of fermentation time on polysaccharide content and cellulase activity

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在2～10 d范圍內(nèi)延長，多糖含量和纖維素酶活均呈先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為2～6 d時(shí)，多糖含量和纖維素酶活均隨之升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)二者達(dá)到峰值，分別為12.5 mg/L和121.7 U/L；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過6 d之后，多糖含量和纖維素酶活均有所下降。發(fā)酵初期營養(yǎng)充足，多糖逐漸積累，發(fā)酵后期營養(yǎng)匱乏，生長環(huán)境改變，菌體進(jìn)入衰亡期，酶活降低，代謝產(chǎn)物不再積累。因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多糖含量（Y）作為響應(yīng)值，選取接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

將表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行非線性多元回歸統(tǒng)計(jì)分析，建立二次多項(xiàng)式的擬合，得到回歸方程如下：Y=12.4+0.7A+0.83B+0.47C+0.075AB+1.03AC-0.52BC-1.56A2-1.46B2-0.66C2。

由表3可知，此模型回歸顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），決定系數(shù)R2為0.971 4，表明97.14%試驗(yàn)結(jié)果能由此方程解釋，校正決定系數(shù)R2adj為0.934 7，反映了93%左右的多糖含量變異散布于接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素內(nèi)，說明模型擬合度較好[24]。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為3.83%，該值反映每個(gè)平均值相對(duì)偏離情況，試驗(yàn)穩(wěn)定性越好CV值越小，因此可以看出本試驗(yàn)具備相對(duì)高的置信度及可靠性。綜上分析，該響應(yīng)面試驗(yàn)可以用于黑木耳發(fā)酵玉米須制備多糖的參數(shù)預(yù)測(cè)。由表3中F值可知，影響多糖含量的主次順序?yàn)椋築（發(fā)酵溫度）＞A（接種量）＞C（發(fā)酵時(shí)間）。由P值可知，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC及二次項(xiàng)A2、B2對(duì)響應(yīng)值影響作用均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)BC及二次項(xiàng)C2對(duì)響應(yīng)值影響作用均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.3 響應(yīng)面曲面圖分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件得到各因素交互作用對(duì)多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線見圖4。3個(gè)響應(yīng)面曲面均為凸形，發(fā)酵過程中的參數(shù)變化對(duì)多糖含量會(huì)產(chǎn)生不同的影響。在所選取的試驗(yàn)范圍內(nèi)，響應(yīng)值存在極大值，可以模擬出該試驗(yàn)的最優(yōu)條件，響應(yīng)面越陡，反映出各因素之間的兩兩交互作用越顯著。由圖4a可知，接種量和發(fā)酵溫度的曲面圖較平緩，因素間交互作用較小，由圖4b和4c可知，發(fā)酵時(shí)間和接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的曲面圖較陡，交互作用對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），這與方差分析結(jié)果一致。隨著發(fā)酵時(shí)間的增大，多糖的含量先增加，而后在較高接種量時(shí)，增幅不大。

圖4 各因素交互作用對(duì)多糖含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on polysaccharide content

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件得出最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量8%、發(fā)酵溫度26 ℃、發(fā)酵時(shí)間7 d。在此條件下得到玉米須多糖含量理論值為12.77 mg/L。此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖含量實(shí)際值為13.12 mg/L，與理論值12.77 mg/L接近，其發(fā)酵液中纖維素酶的活力為130.7 U/L，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際多糖含量。

2.5 玉米須粗多糖的紅外光譜鑒定

由圖5可知，波數(shù)3 392 cm-1處的寬吸收峰在3 200～3600cm-1范圍內(nèi)，為飽和的O-H伸縮振動(dòng)區(qū)域，波數(shù)2929cm-1的吸收峰在2 800～3 000 cm-1范圍內(nèi)，為飽和C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；波數(shù)1 200～1 400 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰屬于C-H的變角振動(dòng)，波數(shù)1 632 cm-1處吸收峰為C=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，波數(shù)1 421 cm-1附近吸收峰為C-H的變形振動(dòng)吸收峰[26]，這些區(qū)域所出現(xiàn)的峰均為糖類的特異吸收峰。

圖5 玉米須粗多糖的紅外光譜測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of infrared spectrum of Stigma maydis crude polysaccharide

2.6 玉米須粗多糖的抗氧化能力分析

由圖6a可知，玉米須粗多糖對(duì)·OH的清除能力存在濃度依賴關(guān)系，在10 mg/mL的質(zhì)量濃度時(shí)，多糖對(duì)·OH的清除能力與0.1 mg/mL VC持平。玉米須粗多糖對(duì)·OH的最大清除率為40%左右。由圖6b可知，黑木耳發(fā)酵玉米須多糖清除DPPH·的能力較強(qiáng)，但弱于VC。質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，多糖的清除能力與溶液質(zhì)量濃度成正比例關(guān)系，在多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其清除率為43.3%。

圖6 玉米須粗多糖對(duì)·OH（a）和DPPH·（b）的清除能力Fig.6 Scavenging ability of Stigma maydis crude polysaccharide on·OH (a) and DPPH·(b)

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)黑木耳發(fā)酵玉米須的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件：接種量為8%、發(fā)酵溫度為26 ℃、發(fā)酵時(shí)間為7 d。此優(yōu)化條件下，多糖含量為13.12 mg/L，其發(fā)酵液中纖維素酶的活力為130.7 U/L，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際提取量。并對(duì)得到的多糖進(jìn)行紅外光譜分析和抗氧化能力分析，結(jié)果表明其紅外譜圖具有糖類物質(zhì)的特征吸收峰，且多糖對(duì)羥基（OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基最大清除率分別為34.5%和43.3%，后續(xù)研究可以對(duì)粗多糖對(duì)進(jìn)行純化，以提高其抗氧化活性。