苑忠霞，宋鳳麗，廖子玲，胡漢瓊，劉 珂

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 100029)

放射治療是惡性腫瘤綜合治療的主要手段，但放射線在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷靶區(qū)內(nèi)正常皮膚組織[1]。急性放射性皮炎(a-RISR)是放射治療常見的并發(fā)癥，伴有皮膚紅斑、脫屑、疼痛、發(fā)熱、瘙癢、潰瘍和出血等不適[2]，制約著腫瘤放射治療的完成。西醫(yī)主要以藥物治療為主，包括重組人表皮生長因子、三乙醇胺乳膏、維生素B12等，但臨床療效有一定的局限性[3]。眾多醫(yī)家認(rèn)為，放射線為外來之邪，其性屬熱，與中醫(yī)燥熱邪氣致病特點(diǎn)相似。a-RISR可歸屬于中醫(yī)學(xué)“瘡瘍”“燒傷”“燙傷”等范疇[4]。四妙勇安湯為“清熱解毒”的經(jīng)典方劑，主治熱毒熾盛之脫疽，現(xiàn)代臨床上廣泛用于治療周圍血管病、糖尿病足及皮膚病變等多種疾病[5]。北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤血液科長期從事中醫(yī)藥防治惡性腫瘤及其并發(fā)癥的研究，對(duì)四妙勇安湯進(jìn)行加減化裁后自擬加味四妙勇安膏，前期研究表明加味四妙勇安膏對(duì)a-RISR有較好的防治作用，考慮與抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成等機(jī)制有關(guān)[6-8]。本研究擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9]進(jìn)一步探究加味四妙勇安膏作用于a-RISR的關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)及通路，并結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)加以驗(yàn)證，為外用加味四妙勇安膏治療a-RISR的后續(xù)研究提供思路。

1 資料與方法

1.1加味四妙勇安膏成分及作用靶點(diǎn)篩選 加味四妙勇安膏成分為金銀花90 g、玄參90 g、當(dāng)歸60 g、黃芪30 g、連翹30 g、蒲公英30 g、紫草30 g、甘草10 g、冰片10 g。運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)[10](TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別檢索加味四妙勇安膏中藥物的化學(xué)成分。由于加味四妙勇安膏為外用制劑，故根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)特性及相關(guān)文獻(xiàn)，以ADME參數(shù)中DL(類藥性)≥0.18和1

1.2a-RISR作用靶點(diǎn)篩選 以“acute radiation induced skin reaction”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫[15](https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫[16](https://omim.org/)中篩選a-RISR作用靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，將得分大于中位數(shù)的靶點(diǎn)作為a-RISR潛在作用靶點(diǎn)。將上述2個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得的所有靶點(diǎn)進(jìn)行匯總?cè)ブ睾蟮玫絘-RISR基因靶點(diǎn)。

1.3藥物-疾病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用Microsoft Excel軟件將藥物與疾病基因靶點(diǎn)取交集，并通過在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制維恩圖。將交集靶點(diǎn)提交到STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，并隱藏游離的靶點(diǎn)，得到靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)及其TSV文件。將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2進(jìn)行度值分析，構(gòu)建PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性進(jìn)行分析和評(píng)估，以篩選核心作用靶點(diǎn)。篩選參數(shù)包括Betweenness Centrality(BC)、Closeness Centrality(CC)、Degree Centrality(DC)、Eigenvector Centrality(EC)、Local Average Connectivity-based method Centrality (LAC)和Network Centrality(NC)。參數(shù)值均滿足大于中位值的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.4GO和KEGG富集分析 將交集靶點(diǎn)輸入Metascape[17](http://metascape.org/gp/index.html)完成GO和KEGG富集分析，GO和KEGG富集分析包含GO生物過程(GO biological process)、GO分子功能(GO molecular function)、GO細(xì)胞成分(GO cellular components)和KEGG途徑(KEGG pathway)，將物種限定為“Homo sapiens”，選擇“custom analysis”,同時(shí)將條件設(shè)定為“P Value Cutoff=0.01”,“Min Overlap=3” and “Min Enrichment=1.5”，并通過在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心成分篩選根據(jù)KEGG富集分析得到的通路對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，結(jié)合靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分，運(yùn)用cytoscape 3.7.2構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路可視化交互網(wǎng)絡(luò)圖，并通過NetworkAnalyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠袛嗪诵淖饔贸煞?，分析參?shù)包括連接度(Degree Centrality)、介度(Betweenness Centrality)和緊密度(Closeness Centrality)。其中節(jié)點(diǎn)代表有效成分、作用靶點(diǎn)和KEGG富集通路，邊代表它們之間的相互作用關(guān)系。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取小分子配體的2D結(jié)構(gòu)，將2D結(jié)構(gòu)輸入ChemOffice軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化并轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)，保存為mol2文件；運(yùn)用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，通過PyMOL軟件將核心靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行刪除水分子和有機(jī)物等處理，保存為PDB文件。采用AutoDockTools軟件把小分子配體和蛋白晶體結(jié)構(gòu)保存為PDBQT文件并確定活性口袋。最后，在命令提示符里運(yùn)行vina分子對(duì)接，并將結(jié)果通過PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1加味四妙勇安膏成分及作用靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中根據(jù)DL≥0.18和1

表1 加味四妙勇安膏中DL值排名前30的化學(xué)成分

2.2a-RISR作用靶點(diǎn) 從GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索到6 743和500個(gè)a-RISR基因靶點(diǎn)。根據(jù)相關(guān)度中位值對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得的基因靶點(diǎn)進(jìn)行3次篩選后得到843個(gè)作用靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)進(jìn)行匯總?cè)ブ睾蠊驳玫? 263個(gè)a-RISR基因靶點(diǎn)。

2.3藥物-疾病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)及核心作用靶點(diǎn) 將藥物和疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到164個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。將交集靶點(diǎn)提交到STRING數(shù)據(jù)庫，隱藏未連接的靶點(diǎn)后下載TSV文件并將其提交到Cytoscape v3.7.2以獲得PPI可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2。運(yùn)用CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，見圖3，得到STAT3、TP53、EP300、MAPK3、AKT1等蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)，具體參數(shù)值見表2。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊诵陌悬c(diǎn)參數(shù)

2.4GO和KEGG富集分析 運(yùn)用Matascape數(shù)據(jù)庫對(duì)164個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并用水平條形圖和氣泡圖可視化富集項(xiàng)，見圖4及圖5。首先，圖4展示了加味四妙勇安膏治療a-RISR主要參與的生物過程包括血管的發(fā)育(bloodvessel development)、凋亡信號(hào)通路(apoptotic signaling pathway)、對(duì)生長因子的反應(yīng)(response to growth factor)等；同時(shí)，圖4得到了細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合(protein domain specific binding)等分子功能條目，主要在膜筏(membrane raft)、囊泡腔(vesicle lumen)、蛋白激酶復(fù)合物(protein kinase complex)等細(xì)胞成分處發(fā)揮作用。KEGG富集結(jié)果包括p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、Wnt 信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)等。此外富集通路還包括VEGF信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kB signaling pathway)及PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。

2.5成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?網(wǎng)絡(luò)由298個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 637條邊組成，從圖中可以看出，同一靶點(diǎn)可以作用于多個(gè)通路，而不同的通路也可以被同一個(gè)靶點(diǎn)所影響，充分體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度(degree)代表它連接其他節(jié)點(diǎn)所含的邊數(shù)；通常認(rèn)為一個(gè)節(jié)點(diǎn)的degree值越大，它發(fā)揮的作用越顯著?；诰W(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，按degree值排名靠前的化合物有槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)和木犀草素(luteolin)等，排名前12的活性成分參數(shù)見表3。

表3 加味四妙勇安膏核心成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

2.6分子對(duì)接驗(yàn)證 核心成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲋衐egree值排名前3的成分為槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)和木犀草素(luteolin)，運(yùn)用CytoNCA對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行運(yùn)算篩選出的核心靶點(diǎn)中，按degree值排名前5分別為STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1，對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接以評(píng)價(jià)活性成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度，結(jié)果見表4。模式圖見圖7，以槲皮素對(duì)接結(jié)果為例，其同STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1的結(jié)合能分別為-6.1，-7.4，-8.2，-8.3和-5.9 kJ/mol，可通過ASP-369、LYS-383、HIS-437、ASN-491和STAT3形成氫鍵，通過ASN-165、ARG-156、ILE-159、GLU-128、LYS-130和TP53形成氫鍵，通過ASN-1132、TYR-1089、GLN-1077和EP300形成氫鍵，通過ARG-87、GLY-186、GLN-83、ARG-84和MAPK3形成氫鍵，通過MET-140和AKT1形成氫鍵。配體(關(guān)鍵成分)和受體(核心靶點(diǎn))的結(jié)合能數(shù)值為負(fù)說明二者可以自發(fā)結(jié)合，數(shù)值≤-5 kJ/mol認(rèn)為配體與受體結(jié)合良好[19]，數(shù)值≤-7 kJ/mol提示有較強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性，且數(shù)值越低，提示兩者的結(jié)合活性就越好[20]。分子對(duì)接結(jié)果提示關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)合能數(shù)值均低于-5 kJ/mol，說明3種關(guān)鍵成分和核心作用靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合力和穩(wěn)定性。

表4 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

近年來，隨著腫瘤發(fā)病率的增加和放射治療的日益普及，放射線往往會(huì)對(duì)受照射區(qū)域皮膚組織造成不同程度的損傷。盡管西醫(yī)治療在臨床上可以取得一定的效果，但仍未建立起針對(duì)a-RISR的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在皮膚疾病治療方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是在改善癥狀方面，大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明中醫(yī)藥在防治a-RISR方面有很好的療效。雷麗等[21]對(duì)紫白黃芪膏防治乳腺癌術(shù)后胸部照射所致放射性皮炎的療效展開研究，發(fā)現(xiàn)紫白黃芪膏能有效延緩放射性皮膚損傷出現(xiàn)的時(shí)間，促進(jìn)皮損愈合，降低放射性皮炎的級(jí)別。段紫鈺等[22]應(yīng)用雙草膏對(duì)大鼠放射性皮炎模型展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙草膏能抑制炎癥因子表達(dá)，減輕皮膚損傷，考慮與阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。丁彤晶等[23]通過對(duì)中醫(yī)外治法治療a-RISR療效進(jìn)行Meta分析，結(jié)果提示在促進(jìn)皮損愈合及改善患者癥狀等方面均表現(xiàn)出一定的積極作用。

本研究通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)度值初步篩選出加味四妙勇安膏治療a-RISR的關(guān)鍵成分有槲皮素、芹菜素和木犀草素等。槲皮素為天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌及心血管保護(hù)等廣泛藥理作用[24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明槲皮素能夠降低成纖維細(xì)胞對(duì)TGF-β的收縮性，減輕放射線引起的皮膚纖維化，改善小鼠放射性皮膚損傷[25]。芹菜素具有抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)等作用，能通過激活A(yù)kt/Nrf2通路、下調(diào)NF-κB表達(dá)以促進(jìn)深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面愈合[26]。木犀草素具有較強(qiáng)的DNA保護(hù)、抗氧化、抗炎及紫外線吸收特性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)木犀草素能上調(diào)人體皮膚前列腺素E2、環(huán)氧酶-2的產(chǎn)生，可以干擾MAPK通路以減輕紫外線引起的皮膚紅斑。故槲皮素、芹菜素、木犀草素可能為發(fā)揮關(guān)鍵作用的活性成分。

通過對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1等核心作用靶點(diǎn)。STAT3為信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族的一員，在特應(yīng)性皮炎、皮膚腫瘤、銀屑病等多種皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。皮膚主要由表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等構(gòu)成，最新研究表明TGF-β-STAT3通路可能與成纖維細(xì)胞的活化相關(guān)，給予STAT3敲除后小鼠成纖維細(xì)胞-TGF-β刺激后發(fā)現(xiàn)可以減少膠原分泌、降低成纖維細(xì)胞分化能力，故STAT3抑制劑很可能成為臨床加快皮損修復(fù)的藥物[27-28]。TP53為抑癌基因p53的突變型，參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。TP53無法停止受損DNA復(fù)制，可能會(huì)引起角質(zhì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和克隆增生[29]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶EP300可通過染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞增殖分化過程中起重要作用。研究表明，過度表達(dá)的KLF4可通過協(xié)同EP300介導(dǎo)銀屑病患者皮損中KRT17的過度表達(dá)，引起炎性反應(yīng)及表皮細(xì)胞周期異常等病理變化[30]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵傳遞者，MAPK3為其成員之一。杜偉斌等[31]通過大鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電針揚(yáng)刺手法可抑制p38 MAPK通路過度活化,發(fā)揮抑制炎癥因子表達(dá)、促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)等作用。AKT家族分別有AKT1、AKT2、AKT3三個(gè)成員，AKT1活性降低可導(dǎo)致絲聚蛋白表達(dá)和加工減少，引起特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚屏障功能受損[32]。因此，STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1可能是加味四妙勇安膏活性成分作用于a-RISR的核心靶點(diǎn)。

對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析后，得到p53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路，還包括VEGF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路及PI3K-Akt信號(hào)通路等。p53和Wnt信號(hào)通路均參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程。研究發(fā)現(xiàn)，放射線引起的皮膚損傷創(chuàng)面細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)可引起細(xì)胞過度凋亡，為皮膚潰瘍形成發(fā)展的關(guān)鍵因素[33]。放射性皮膚損傷存在輻射后微血管損傷現(xiàn)象，VEGF等血管生成介質(zhì)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、細(xì)胞增殖及遷移等，通過調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路可以對(duì)輻射后損傷組織的修復(fù)發(fā)揮重要作用[34-35]。劉鑫等[36]運(yùn)用四妙勇安湯對(duì)尾動(dòng)脈血管吻合術(shù)后吻合口再狹窄大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明，四妙勇安湯能調(diào)節(jié)VEGF蛋白水平變化，加快血管修復(fù)。NF-κB被證實(shí)在調(diào)控炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，何衛(wèi)東等[37]構(gòu)建竹葉青蛇傷動(dòng)物及細(xì)胞模型，研究結(jié)果表明NF-κB信號(hào)通路為竹葉青蛇傷血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的關(guān)鍵。李光輝等[38]開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯及其單體可通過抑制NF-κB p65mRNA的表達(dá)來減少血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素的表達(dá)；而P-選擇素在白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附中起重要作用。PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典的信號(hào)通路，與增殖、分化和凋亡相關(guān)。王曉妮等[39]通過大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)松蘿酸可能調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路以減輕大鼠皮損炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。故推測(cè)加味四妙勇安膏可能通過調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用以加速損傷組織愈合。

分子對(duì)接結(jié)果表明，加味四妙勇安膏的關(guān)鍵活性成分槲皮素、芹菜素和木犀草素同核心靶點(diǎn)STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1的結(jié)合能數(shù)值均小于-5 kJ/mol，說明均具有較高的藥效活性。以上結(jié)果提示關(guān)鍵成分可能通過作用于以上潛在核心靶點(diǎn)發(fā)揮治療a-RISR的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接驗(yàn)證，預(yù)測(cè)加味四妙勇安膏有效成分槲皮素、芹菜素、木犀草素等通過與STAT3、TP53、EP300、MAPK3和AKT1等核心靶點(diǎn)相互作用，調(diào)節(jié)p53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善血管損傷、促進(jìn)膠原纖維形成等治療作用促進(jìn)皮損組織愈合，符合中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。本研究對(duì)闡明加味四妙勇安膏治療a-RISR的機(jī)制具有參考意義，但選擇不同的算法可能會(huì)產(chǎn)生不同的預(yù)測(cè)結(jié)果，且藥物和疾病之間存在量效關(guān)系，疾病的發(fā)生、藥物的發(fā)展和藥效過程也是動(dòng)態(tài)變化的，故該結(jié)論有待進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。