劉 利，周佩夏，邊 娜，王旭輝，王 坤，趙國靜，胡海波，陸學(xué)超

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250014；2. 青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033)

肺癌是發(fā)病率和病死率極高的惡性腫瘤之一,且多數(shù)患者確診時就處于Ⅲ期或Ⅳ期，無法接受手術(shù)治療[1-2]?；熓欠伟┗颊?，尤其是晚期肺癌患者綜合治療主要手段之一，順鉑是一線化療藥物，其通過與目標(biāo)DNA結(jié)合改變其結(jié)構(gòu)方式阻止目標(biāo)DNA復(fù)制，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡[3]。然而，化療藥物缺乏特異性，在其殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會損害人體正常的細(xì)胞，影響消化、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)，引發(fā)各種不良反應(yīng)[4]。多項研究證實，中醫(yī)藥在腫瘤的治療中發(fā)揮著積極作用，其可以通過提高機體免疫功能[5]，減輕炎性反應(yīng)、改善腫瘤微環(huán)境[6]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等途徑遏制腫瘤生長[7]，同時可減輕化療藥物帶來的不良反應(yīng)[8]，改善患者喘憋、疼痛等臨床癥狀，延長生存時間。腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖的失衡使得腫瘤組織增大、轉(zhuǎn)移，因此促進腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制、減慢其增殖，是抗腫瘤治療的重要方向。黃夏白冬消癌湯是臨床治療肺癌的有效方劑，但其作用機制尚不明確。本實驗通過建立肺癌荷瘤小鼠模型，以凋亡信號通路Bax/Bcl-2/Caspase-3及NF-κB p65為靶點，探討了黃夏白冬消癌湯治療肺癌的分子生物學(xué)機制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 40只雄性C57BL/6小鼠，體重18～22 g，購自北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2019-0008。將其飼養(yǎng)于SPF級的動物室內(nèi)，室溫20～24 ℃，相對濕度50%～70%，給予無菌飼料及無菌水，自由飲食。研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理審核通過(QDU-AEC-2022140)。

1.2瘤株、試劑與儀器 小鼠Lewis肺癌瘤株，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；RNA提取(貨號：DP431)、反轉(zhuǎn)錄(貨號：KR106-02)、擴增試劑盒(貨號：KT109)，天根生物科技有限公司；qPCR試劑(貨號：10032048)、PBS磷酸鹽緩沖液(貨號：1610780)、DAB顯色試劑盒(貨號：1706535)，美國Bio-Rad公司；兔抗Bax(貨號：ab81083)、Bcl-2(貨號：ab238042)、Caspase-3 (貨號：ab208161)、NF-κB p65(貨號：ab76311)抗體，艾博抗貿(mào)易有限公司。熒光定量PCR儀，Bio-RAD公司(型號：iQTM5)。

1.3藥物 順鉑注射液，齊魯制藥有限公司，批號：8K029A89，規(guī)格：10 mg/支。黃夏白冬消癌湯組方：黃芪30 g、防己15 g、川芎15 g、夏枯草30 g、僵蠶15 g、白英15 g、海浮石30 g、麥冬15 g，生藥由青島市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。將上述生藥放置于清潔容器中，倒入蒸餾水浸泡30 min，水位超過藥材2 cm，煎煮40 min，無菌紗布濾出藥液，再加蒸餾水同法煎煮，混合2次藥液，分別將煎煮藥液濃縮至2 g/mL、4 g/mL,分別記為低劑量、高劑量，放置于4 ℃保存?zhèn)溆茫Ｙ|(zhì)期為1周。

1.4實驗方法 小鼠于動物實驗室預(yù)飼養(yǎng)1周后進行模型制備：取細(xì)胞濃度為1×107/mL的Lewis肺癌細(xì)胞懸液，于小鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL，1周后如在小鼠右腋下可觸及豆粒大小的腫物即為模型制備成功。然后將荷瘤小鼠隨機分為模型組、順鉑組、黃夏白冬消癌湯低劑量組、黃夏白冬消癌湯高劑量組，每組10只。順鉑組給予順鉑2 mg/kg腹腔注射，每2 d 1次，連續(xù)注射14 d；黃夏白冬消癌湯低、高劑量組分別給予2 g/mL、4 g/mL黃夏白冬消癌湯0.2 mL灌胃，模型組給予生理鹽水0.2 mL灌胃，均1次/d，連續(xù)灌胃14 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1腫瘤體積及抑瘤率 分別于干預(yù)2，4，6，8，10，12，14 d運用游標(biāo)卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑與短徑，計算腫瘤體積，計算公式：腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2；末次干預(yù)結(jié)束后脫頸椎處死各組小鼠，剝離皮下瘤體稱重，計算抑瘤率，計算公式：抑瘤率=(模型組平均瘤重-藥物干預(yù)組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5.2腫瘤組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleved-Caspase-3蛋白表達情況 采用Western Blot法檢測：提取腫瘤組織蛋白，制備蛋白樣本。行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜后加入5%脫脂牛奶搖床上封閉2 h，加入稀釋倍數(shù)均為1∶1 000的一抗，4 ℃震蕩孵育過夜。洗膜3遍后加入二抗，在室溫條件下孵育2 h，洗滌?；瘜W(xué)發(fā)光顯色成像，通過Image J分析灰度值，并計算p-NF-κB p65/NF-κB p65、Bax/Bcl-2、Cleved-Caspase-3/Caspase-3 比值。

1.5.3腫瘤組織中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達情況 采用qPCR法檢測：取小鼠腫瘤組織，使用PBS溶液清洗后，加入Trizol試劑將其裂解，提取小鼠腫瘤組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA作為模板，按照試劑盒說明分別加入引物(引物序列見表1)和SuperReal PreMix Plus等，擴增反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法進行相對定量分析。

表1 肺癌組織中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組荷瘤小鼠腫瘤生長曲線 4組小鼠腫瘤均呈增長態(tài)勢，模型組小鼠腫瘤生長迅速。干預(yù)6～14 d期間，黃夏白冬消癌湯低劑量組各時間點腫瘤體積雖低于模型組，但2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；順鉑組及黃夏白冬消癌湯高劑量組腫瘤生長延緩，腫瘤體積均明顯低于同期模型組及黃夏白冬消癌湯低劑量組(P均<0.05)，順鉑組與黃夏白冬消癌湯高劑量組各時間點腫瘤體積比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

2.2各組荷瘤小鼠腫瘤增殖抑制率比較 黃夏白冬消癌湯低劑量組小鼠瘤重與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；順鉑組及黃夏白冬消癌湯高劑量組小鼠瘤重均明顯低于模型組與黃夏白冬消癌湯低劑量組(P均<0.05)，且抑瘤率均明顯高于黃夏白冬消癌湯低劑量組，順鉑組與黃夏白冬消癌湯高劑量組瘤重與抑瘤率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組Lewis肺癌小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.3各組荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleved-Caspase-3蛋白表達情況 順鉑組及黃夏白冬消癌湯低、高劑量組p-NF-κB p65/NF-κB p65均明顯低于模型組(P均<0.05)，Cleved-Caspase-3/Caspase-3 均明顯高于模型組(P均<0.05)；順鉑組及黃夏白冬消癌湯高劑量組Bax/Bcl-2明顯高于模型組(P均<0.05)，黃夏白冬消癌湯低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；黃夏白冬消癌湯低、高劑量組p-NF-κB p65/NF-κB p65均明顯高于順鉑組(P均<0.05)，Cleved-Caspase-3/Caspase-3均明顯低于順鉑組(P均<0.05)；黃夏白冬消癌湯高劑量組Bax/Bcl-2與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，黃夏白冬消癌湯低劑量組明顯低于順鉑組(P<0.05)；黃夏白冬消癌湯高劑量組的p-NF-κB p65/NF-κB p65、Bax/Bcl-2均明顯高于黃夏白冬消癌湯低劑量組(P均<0.05)，2組Cleved-Caspase-3/Caspase-3比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2及圖3。

2.4各組荷瘤小鼠腫瘤組織中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較 順鉑組及黃夏白冬消癌湯低、高劑量組NF-κB p65、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)；順鉑組及黃夏白冬消癌湯高劑量組Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，黃夏白冬消癌湯低劑量組Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；黃夏白冬消癌湯低、高劑量組Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量均明顯低于順鉑組(P均<0.05)，Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于順鉑組(P均<0.05)，NF-κB p65mRNA相對表達量與順鉑組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，黃夏白冬消癌湯低、高劑量組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較

3 討 論

中醫(yī)將“肺癌”歸屬于“肺積”“息賁”“積聚”“癥瘕”等范疇。關(guān)于其核心病機，目前主流學(xué)術(shù)觀點多認(rèn)為是正虛邪實[9-11]。在肺癌演變過程中，正虛主要以氣虛、陰虛、陽虛為主，邪實以痰、瘀、毒(熱)為主，因虛致實，因?qū)嵵绿?，惡性循環(huán)，終致邪實凝結(jié)成癌。因此，中醫(yī)治療肺癌應(yīng)以扶正祛邪為根本治法。黃夏白冬消癌湯正是基于上述認(rèn)識，結(jié)合臨床實踐組方而成，該方含4個“藥對”，其中黃芪、防己歸肺經(jīng)，合用可益氣扶正祛水濕；夏枯草、僵蠶配伍可軟堅散結(jié)、緩消癥瘕；麥冬、海浮石聯(lián)用可養(yǎng)陰潤肺祛頑痰；白英、川芎同用具有理氣活血、清熱解毒之效。上述8味藥物環(huán)環(huán)相扣，彼此兼顧，相使相佐，可明顯改善肺癌患者癥狀，延緩病情進展。本實驗結(jié)果顯示，黃夏白冬消癌湯高劑量組和順鉑組腫瘤生長延緩，腫瘤體積明顯低于模型組，黃夏白冬消癌湯高劑量組腫瘤體積、抑瘤率比較差異不明顯，證實黃夏白冬消癌湯可明顯抑制Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長。

細(xì)胞凋亡是機體在生理和病理條件下發(fā)生的自主、協(xié)調(diào)、有序的細(xì)胞死亡過程，該過程受多種因素調(diào)控，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色，與腫瘤的惡化、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。線粒體途徑是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，內(nèi)源性刺激觸發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C等可溶性膜間隙蛋白，激活半胱天冬酶，導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞快速死亡[12]，而這一過程受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控。Bcl-2蛋白家族由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白組成，二者的協(xié)調(diào)平衡維持著細(xì)胞凋亡正常進行[13-14]。Bax與Bcl-2相互拮抗，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bcl-2可與Bax形成同源的蛋白二聚體，當(dāng)Bax表達處于優(yōu)勢地位時，拮抗Bcl-2發(fā)揮作用，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[15-16]。Caspase家族處于細(xì)胞凋亡的下游，是凋亡過程執(zhí)行任務(wù)的主要力量[17]。Caspase-3是Caspase家族的核心激酶，激活后可轉(zhuǎn)化為Cleaved-Caspase-3，直接導(dǎo)致細(xì)胞解體[18]。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在相關(guān)因素的刺激下被激活，其活化物主要為NF-κB p50和NF-κB p65，可調(diào)控細(xì)胞因子、血管生成因子和與腫瘤進展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的酶等多種基因的表達[19]。有研究表明，NF-κB p65 活化為p-NF-κB p65，可上調(diào)下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[20-21]。本實驗結(jié)果顯示，黃夏白冬消癌湯、順鉑干預(yù)均可顯著上調(diào)Bax、Caspase-3表達，下調(diào)Bcl-2、NF-κB p65表達，抑制NF-κB p65磷酸化，促進Caspase-3活化，啟動 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且高劑量黃夏白冬消癌湯的作用與順鉑相當(dāng)。

綜上所述，黃夏白冬消癌湯可通過調(diào)控Bax/ Bcl-2/Caspase-3信號通路，促進細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，與順鉑或其他癌癥治療方法結(jié)合使用可能效果更好。關(guān)于黃夏白冬消癌湯在抗癌治療中的其他作用途徑仍需進一步探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。