劉丹寧，黃國(guó)東，楊鑫勇，周嫦艷，王亞南

基于IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路研究復(fù)方仙草顆粒抑制糖尿病腎病足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制

劉丹寧1，黃國(guó)東2*，楊鑫勇1，周嫦艷1，王亞南1

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530000

基于胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，F(xiàn)OXO4）信號(hào)通路探討復(fù)方仙草顆粒抑制糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）大鼠腎足細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用機(jī)制。采用單側(cè)腎切除、高糖高脂飼料喂養(yǎng)及一次性ip鏈脲佐菌素制備DN模型大鼠，另設(shè)置對(duì)照組和假手術(shù)組，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦（15.75 mg/kg）組和復(fù)方仙草顆粒組低、中、高劑量（315.0、472.5、945.0 mg/kg）組，各給藥組ig相應(yīng)藥物，連續(xù)6周。檢測(cè)各組大鼠空腹血糖、腎臟指數(shù)（kidney index，KI）、尿微量白蛋白/肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎組織病理變化；采用透射電鏡（TEM）觀察腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；采用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)大鼠腎組織足細(xì)胞裂孔膜蛋白（）、P-鈣黏蛋白（）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，）、、成纖維細(xì)胞特異蛋白-1（fibroblast specific protein-1，）及IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠KI、UACR、BUN水平均顯著升高（＜0.05），腎小球肥大，腎小管廣泛擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性脫落，足突融合或丟失；腎組織nephrin、P-cadherin表達(dá)顯著降低（＜0.05），α-SMA、Desmin、FSP-1表達(dá)顯著升高（＜0.05），IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低（＜0.05）。與模型組比較，復(fù)方仙草顆粒組大鼠KI、UACR、BUN水平顯著降低（＜0.05），腎臟病理結(jié)構(gòu)和足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯改善；腎組織nephrin、P-cadherin表達(dá)顯著升高（＜0.05），α-SMA、Desmin、FSP-1表達(dá)顯著降低（＜0.05），IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高（＜0.05）。復(fù)方仙草顆粒能夠通過調(diào)節(jié)IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路改善DN大鼠腎功能，抑制DN大鼠足細(xì)胞EMT，減輕足細(xì)胞損傷。

復(fù)方仙草顆粒；糖尿病腎??；足細(xì)胞；上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；胰島素受體底物2/磷脂酰肌醇-3-激酶/叉頭框蛋白O4信號(hào)通路

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）作為糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，已成為一個(gè)日趨嚴(yán)重的全球性健康問題，目前我國(guó)糖尿病患者大約為9500萬(wàn)，還有約1.5億患者處于糖尿病前期階段[1]。1型和2型糖尿病均可發(fā)展為DN，DN主要由微血管病變引起，是導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎功能衰竭甚至死亡的重要因素，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)DN缺乏特異性有效的治療方法[2]。因此，尋找預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)已成為治療DN急需解決的問題。

高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、線粒體損傷等導(dǎo)致腎足細(xì)胞凋亡和功能損傷，是推進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展的重要因素。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的最后一道屏障，蛋白尿是腎小球?yàn)V過屏障受損的標(biāo)志，DN的進(jìn)展與足細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)，但其作用機(jī)制尚未明確[3-4]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是DN中足細(xì)胞功能障礙和足細(xì)胞減少的潛在機(jī)制，當(dāng)受到損傷時(shí)，足細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的表型改變，其高度特化的足細(xì)胞標(biāo)志物如足細(xì)胞裂孔膜蛋白（nephrin）、P-鈣黏蛋白（P-cadherin）停止表達(dá)，而纖維細(xì)胞特異蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）、Desmin、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等開始表達(dá)[5]。

復(fù)方仙草顆粒由八仙草、三七、黃芪、（制）大黃、薏苡仁、甘草組成，有健脾益腎、清熱利濕、活血解毒之功效，是壯醫(yī)有效驗(yàn)方，臨床應(yīng)用證實(shí)該方能夠改善早期DN患者的腎功能、內(nèi)皮功能、血液流變學(xué)及免疫功能[6]，并對(duì)IgA腎病起到有效的治療作用[7]；能夠影響腎臟線粒體自噬從而保護(hù)腎功能，抑制腎損傷[8]。毒理研究顯示該方安全無毒[9]，并制定了行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（以人參皂苷Rb1計(jì)）[10]。本研究擬從分子細(xì)胞水平、基因水平闡述復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠與EMT相關(guān)指標(biāo)的影響，為復(fù)方仙草顆粒的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)No.430727211100630627。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)，相對(duì)濕度50%～70%，溫度23～26 ℃，自然晝夜節(jié)律。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DW20210321-056）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方仙草顆粒（批號(hào)201202，人參皂苷Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.89 mg/g，10 g/包）由廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院壯瑤藥研發(fā)中心生產(chǎn)；厄貝沙坦（150 mg/片，批號(hào)210329JT）購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，批號(hào)S8050）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；大鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒（批號(hào)RR7B2Q48AG）、胰島素ELISA試劑盒（批號(hào)FTNR2NC6Z9）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號(hào)C013-2-1）、肌酐試劑盒（批號(hào)C011-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，F(xiàn)OXO4）抗體（批號(hào)BC106761）、P-cadherin抗體（批號(hào)BC041846）、α-SMA抗體（批號(hào)BC017554）、Desmin抗體（批號(hào)BC032116）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)BC00100134）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體（批號(hào)BC030815）、FSP-1抗體（批號(hào)BC016300）購(gòu)自武漢Proteintech公司；胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）抗體（批號(hào)ab134101）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；提取總RNA試劑盒（批號(hào)A6010）購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)C31430100）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（批號(hào)C31430101）、nephrin抗體（批號(hào)AB-11153994）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗體（批號(hào)bs-3332R）、磷酸化IRS2（phosphorylated IRS2，p-IRS2）抗體（批號(hào)bs-5397R）購(gòu)自北京博奧森生物有限公司。

1.3 儀器

HT7700型透射電子顯微鏡（TEM，日本HITACHI公司）；GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；732BR2019型化學(xué)發(fā)光成像儀、4100624型高通量酶標(biāo)儀篩選系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）；2809152型PCR儀（Biometer公司）；UC7型超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；58595型超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；05815916001型qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）。

2 方法

2.1 DN模型的制備

SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，取40只大鼠制備DN模型[11-14]。大鼠喂食高糖高脂飼料，以右側(cè)臥位固定于鼠板上，在大鼠耳尖與尾巴連線和右肋弓下緣交點(diǎn)處做1 cm左右的橫行切口，切口后將右腎從切口中推擠出體外，充分暴露右腎，切除右腎，縫合后消毒切口；術(shù)后1個(gè)月，大鼠禁食不禁水12 h，一次性ip STZ（40 mg/kg），3 d后，連續(xù)3 d尾靜脈采血測(cè)得血糖≥16.7 mmol/L為DN大鼠。同時(shí)連續(xù)2次留取24 h尿，測(cè)尿微量白蛋白、24 h尿蛋白定量。當(dāng)24 h尿蛋白定量≥30 mg或尿微量白蛋白與肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）＞30 mg/g，則認(rèn)定DN模型成立。另取10只大鼠作為對(duì)照組，10只大鼠作為假手術(shù)組，對(duì)照組不做任何處理，自由進(jìn)食飲水，用普通飼料喂養(yǎng)；假手術(shù)組切口后行暴露左腎縫合切口，并ip 0.1 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)過程中，2只大鼠因術(shù)中失血過多死亡，4只大鼠因無法耐受STZ毒性死亡，4只未達(dá)DN成模標(biāo)準(zhǔn)予以剔除。

2.2 分組及給藥

根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法，將DN大鼠分為模型組、厄貝沙坦（15.75 mg/kg）組和復(fù)方仙草顆粒低、中、高劑量（315、472.5、945 mg/kg）組，每組6只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)6周。每周測(cè)定1次空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），給藥結(jié)束后，留取24 h尿，禁食不禁水12 h，腹主動(dòng)脈取血；取腎臟，稱定質(zhì)量，隨后立刻取腎皮質(zhì)（2 mm×2 mm），置于電鏡固定液中常溫固定2 h后，4 ℃固定24 h；沿腎臟縱軸切開，一半置于4%多聚甲醛溶液中，另一半取腎皮質(zhì)部分于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大鼠一般情況、腎臟指數(shù)（kidney index，KI）及腎功能指標(biāo)的檢測(cè)

觀察給藥前后大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水以及皮毛色澤變化等情況，計(jì)算KI；按試劑盒說明書測(cè)定血清中BUN和肌酐含量，按ELISA試劑盒說明書測(cè)定尿微量白蛋白含量。

KI＝腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 FBG、FINS及HOMA-IR的檢測(cè)

末次給藥后，于大鼠進(jìn)食6～8 h后測(cè)量大鼠FBG；按ELISA試劑盒說明書測(cè)定空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）后，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment，HOMA-IR）。

HOMA-IR＝FINS×FBG/22.5

2.5 腎組織病理及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

將固定于4%多聚甲醛溶液的腎組織修剪至合適大小，梯度脫水，石蠟包埋，將蠟塊切成4 μm厚度，置于載玻片上，烤片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)。

將固定于電鏡固定液的組織進(jìn)行梯度脫水，使用丙酮-812包埋劑（1∶1）包埋，丙酮-812包埋劑（1∶2）滲透過夜，37 ℃烤箱過夜，60 ℃烤箱聚合48 h；超薄切片機(jī)切片，鈾鉛雙染色，切片室溫干燥過夜，于TEM下觀察足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，采集圖像后用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 免疫組化法檢測(cè)腎組織足細(xì)胞標(biāo)志物和EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)

將腎組織切片脫蠟，梯度乙醇水化后，PBS沖洗3次；95 ℃微波抗原修復(fù)10 min，PBS沖洗3次；加入山羊血清封閉20 min，分別滴加α-SMA抗體（1∶200）、nephrin抗體（1∶500）、P-cadherin抗體（1∶500）、Desmin抗體（1∶200）、FSP-1抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜；漂洗后，滴加二抗，孵育后沖洗，加入DAB顯色液，二甲苯透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察蛋白陽(yáng)性表達(dá)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均吸光度（）值。

2.7 qRT-PCR檢測(cè)腎組織足細(xì)胞標(biāo)志物、EMT標(biāo)志物和IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)

取低溫保存的腎組織5～10 mg，放入鋼珠，用冷凍研磨儀將組織研磨成勻漿，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

2.8 Western blotting檢測(cè)腎組織足細(xì)胞標(biāo)志物、EMT標(biāo)志物和IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取低溫保存的腎組織20 mg，置于裝有RIPA裂解液的離心管，放入鋼珠，用冷凍研磨儀將組織勻漿（10 000 r/min、5 min），取出鋼珠，冰上裂解20 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將上清液與5×上樣緩沖液混勻煮沸，得到變性蛋白。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉；分別加入p-IRS2抗體（1∶10 000）、IRS2抗體（1∶3000）、p-PI3K抗體（1∶10 000）、PI3K抗體（1∶10 000）、FOXO4抗體（1∶3000）、α-SMA抗體（1∶6000）、nephrin抗體（1∶2000）、P-cadherin抗體（1∶2000）、Desmin抗體（1∶50 000）和GAPDH抗體（1∶20 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，加入相應(yīng)二抗，常溫孵育1 h，TBST洗滌5次，加入ECL發(fā)光試劑顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 NephrinF: 5’-GGCTCTGACCACACCAACATCC-3’ R: 5’-GAGTGAGGGCTTATGCTGACAAC-3’ α-SMAF: 5’-GGCTATGCTCTGCCTCAT-3’ R: 5’-GGACGATCTCACGCTCA-3’ DesminF: 5’-CAGCAACAGGGACAATGA-3’ R: 5’-CACAGCCAACATGGAAGA-3’ P-cadherinF: 5’-TGTCTTGCCTCGGAACA -3’ R: 5’-TAAGCACCACCCCATT-3’ IRS2F: 5’-CCACTGCTGGCTCCTCA-3’ R: 5’-GTCACTCGGGCACCTTCT-3’ PI3KF: 5’-TGTCTTGCCTCGGAACA-3’ R: 5’-CAAACTCCAGCCACACATT-3’ FOXO4F: 5’-CTGTCACCCTTGTCCTTGA-3’ R: 5’-TGCAGAACTCATCAGCCA-3’ FSP-1F: 5’-CAGCAACAGGGACAATGA-3’ R: 5’-CACAGCCAACATGGAAGA-3’ β-actinF: 5’-ATCATTGCTCCTCCTGAGCG-3’ R: 5’-CAGCTCAGTAAVAGTCCGCC-3’

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠一般情況和腎臟外觀的影響

對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠毛發(fā)順滑，反應(yīng)靈敏，一般情況較好；模型組大鼠精神欠佳，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)枯黃雜亂，掉毛嚴(yán)重，身上出現(xiàn)斑禿現(xiàn)象，進(jìn)食量和飲水量與日劇增，但體質(zhì)量減輕，尿量增多。各給藥組大鼠相較于模型組大鼠精神稍好，反應(yīng)稍遲鈍，進(jìn)食量和飲水量相較于對(duì)照組大鼠增加，但少于模型組大鼠，體質(zhì)量變化起伏不大。

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠由于單側(cè)腎切除術(shù)后僅有1個(gè)腎臟進(jìn)行全身的代謝活動(dòng)并且無藥物干預(yù)，因此腎臟明顯大于對(duì)照組大鼠腎臟；與模型組比較，各給藥組腎臟略小于模型組大鼠腎臟，且各組間基本無差別。

3.2 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠KI及腎功能的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠KI、UACR、BUN無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠KI、UACR和BUN水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠KI、UACR和BUN水平均顯著降低（＜0.05）。

3.3 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠FBG、HOMA-IR均顯著升高（＜0.05），F(xiàn)INS顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、HOMA-IR均顯著降低（＜0.05），F(xiàn)INS顯著升高（＜0.05）。

圖1 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎臟外觀的影響

表2 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠KI及腎功能指標(biāo)的影響()

與對(duì)照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05，下表同

*< 0.05control group;#< 0.05model group, same as below tables

表3 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的影響()

3.4 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織病理及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞未見明顯變性，腎小球結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞未見增生，組織未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)重度異常，腎小管廣泛擴(kuò)張，上皮細(xì)胞變性脫落，部分上皮細(xì)胞氣球樣變，胞質(zhì)完整消失，間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球肥大，毛細(xì)血管袢擴(kuò)張；與模型組比較，各給藥組腎組織各種損傷較輕，部分腎小管擴(kuò)張，個(gè)別腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量減少并可見氣球樣變，腎小球輕度肥大，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

TEM結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎皮質(zhì)與對(duì)照組無明顯差異；模型組大鼠足突約有80%融合，部分足突變寬，基底膜局部增寬，厚薄不均勻，線粒體可見輕度腫脹，大小不均，部分嵴減少，基質(zhì)溶解空泡變。與模型組比較，厄貝沙坦組和復(fù)方仙草顆粒高劑量組足突融合40%左右，基底膜厚薄較均勻；復(fù)方仙草顆粒低劑量組足突融合程度70%左右，基底膜局部增寬，線粒體未見腫脹；復(fù)方仙草顆粒中劑量組足突融合程度60%左右，基底膜局部增寬，線粒體未見腫脹。

3.5 免疫組化法檢測(cè)腎組織足細(xì)胞標(biāo)志物和EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)

如圖3和表4所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠EMT標(biāo)志物（Desmin、α-SMA、FSP-1）和足細(xì)胞標(biāo)志物（nephrin、P-cadherin）蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義，模型組大鼠腎組織Desmin、α-SMA、FSP-1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），nephrin蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）；厄貝沙坦組和復(fù)方仙草顆粒中、高劑量組Desmin、FSP-1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），P-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）。

圖2 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織病理(A) 及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(B) 的影響

圖3 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin、Desmin和FSP-1蛋白表達(dá)的影響 (免疫組化, ×400)

表4 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin、Desmin和FSP-1蛋白表達(dá)的影響()

3.6 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表達(dá)的影響

如表5所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腎組織、、、和mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠腎組織、、mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05），、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織、、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

3.7 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織IRS2、PI3K和FOXO4 mRNA表達(dá)的影響

如表6所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腎組織、和mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠腎組織、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

表5 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

表6 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織IRS2、PI3K和FOXO4mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

3.8 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin和Desmin蛋白表達(dá)的影響

如圖4和表7所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

圖4 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、Desmin和P-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表7 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、Desmin和P-cadherin蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.9 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/ FOXO4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5和表8所示，與對(duì)照組比較，假手術(shù)組大鼠腎組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、FOXO4蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，模型組大鼠腎組織p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05）。

圖5 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

糖尿病是由于胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足、靶細(xì)胞胰島素敏感性下降或胰島素自身結(jié)構(gòu)缺陷而導(dǎo)致代謝紊亂的慢性疾病[15-16]。持續(xù)性高血糖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂可導(dǎo)致DN、糖尿病足和神經(jīng)病變等一系列并發(fā)癥。腎足細(xì)胞是黏附于腎小球基底膜外側(cè)高度分化的細(xì)胞，與腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障[17]。EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有特定表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是腎間質(zhì)纖維化和腎功能喪失的主要機(jī)制之一[18]。研究表明，當(dāng)足細(xì)胞出現(xiàn)EMT時(shí)，可促使足細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)性，導(dǎo)致足細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)及表型破壞，進(jìn)而使其骨架改變[19]，是腎足細(xì)胞脫落和凋亡前的一個(gè)過程[17]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方仙草顆粒干預(yù)后，DN大鼠腎組織病理形態(tài)改善，足細(xì)胞足突融合減少，基底膜厚度相對(duì)均一，線粒體未見腫脹，高度特化的足細(xì)胞標(biāo)志物nephrin、P-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，而EMT標(biāo)志蛋白α-SMA、Desmin、FSP-1等表達(dá)則顯著降低。表明復(fù)方仙草顆粒能夠改善DN足細(xì)胞損傷，抑制腎足細(xì)胞EMT，改善腎功能。

厄貝沙坦為血管緊張素II受體拮抗劑，能夠選擇性切斷血管緊張素轉(zhuǎn)換酶I和受體血管緊張素II結(jié)合，減少醛固酮分泌從而控制血管收縮，減輕腎臟損害[20]，具有降血壓、減少蛋白尿、組織相容性好、脂溶性高等特點(diǎn)，能選擇性對(duì)出球小動(dòng)脈進(jìn)行擴(kuò)張[21]，從而降低腎小球內(nèi)高壓情況，改善腎小球的高濾過[22]；并且能夠明顯改善腎足細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)，保護(hù)腎足細(xì)胞，改善腎功能[23-24]；對(duì)腎組織的炎癥因子有抑制作用[25]，能夠延緩腎間質(zhì)的纖維化[26]。研究已證實(shí)，厄貝沙坦能夠激活PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）[27-28]、IRS2/PI3K/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter，GLUT）[29-30]等信號(hào)通路，因此選用厄貝沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

表8 復(fù)方仙草顆粒對(duì)DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

胰島β細(xì)胞功能受損引發(fā)胰島素分泌不足或胰島素抵抗是引起2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制[31]。IRS2是有絲分裂發(fā)生的主要介質(zhì)[32]，能夠調(diào)節(jié)胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1等細(xì)胞因子；p-IRS2可以激活PI3K/Akt通路[33-36]，從而介導(dǎo)FOXO4活性。FOXO因子可與多種靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，并控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的幾個(gè)關(guān)鍵過程[3]，大量研究證明，F(xiàn)OXO作為調(diào)節(jié)下游靶基因以抵消細(xì)胞壓力的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控體內(nèi)的氧化應(yīng)激、代謝、免疫以及細(xì)胞凋亡等生物過程[32-33]。研究表明，IRS2與腎皮質(zhì)纖維化有關(guān)[37-38]，PI3K能夠改善DN大鼠腎臟細(xì)胞的葡萄糖代謝和水鹽代謝紊亂[38]，也可通過Akt途徑上調(diào)FOXO3、FOXO3a、FOXO4[39-41]。FOXO4與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵性作用，且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖[42]、抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[43]。本研究結(jié)果表明復(fù)方仙草顆粒能夠改善DN大鼠胰島素功能，從而分泌胰島素，與胰島素受體結(jié)合，導(dǎo)致胰島素磷酸化和IRS2酪氨酸位點(diǎn)磷酸化，p-IRS2可以激活PI3K及其下游分子[33-35]，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖原合成。酪氨酸磷酸化后的IRS2與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合，進(jìn)而激活PI3K?；罨腜I3K將磷脂酰肌醇一磷酸轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作為其第二信使激活A(yù)kt[36,44-45]，從而介導(dǎo)FOXO家族的活性。

綜上所述，復(fù)方仙草顆粒能夠改善DN大鼠足細(xì)胞EMT，減輕足細(xì)胞損傷，具有較好的保護(hù)腎臟的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控IRS2/PI3K/FOXO4信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Compound Xianchao Granules on inhibiting epithelial mesenchymal transformation in diabetic nephropathy podocytes based on IRS2/ PI3K/FOXO4 signaling pathway

LIU Dan-ning1, HUANG Guo-dong2, YANG Xin-yong1, ZHOU Chang-yan1, WANG Ya-nan1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, China 2. Guangxi International Zhuang Medicine Hospital, Nanning 530000, China

To investigate the mechanism of Compound Xiancao Granules (復(fù)方仙草顆粒) on inhibiting epithelial-mesenchymal transition (EMT) of renal podocytes in diabetic nephropathy (DN) rats based on insulin receptor substrate 2 (IRS2)/phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/forkhead box O4 (FOXO4) signaling pathway.DN model rats were prepared by unilateral nephrectomy, high sugar and high fat diet and one-time ip streptozocin, control group and sham-operated group were set up. Successfully modeled rats were randomly divided into model group, irbesartan (15.75 mg/kg) group, Compound Xiancao Granules low-, medium- and high-dose (315, 472.5, 945 mg/kg) groups, and each administration group was ig corresponding drugs for six weeks. Fasting blood glucose, kidney index (KI), urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR) and blood urea nitrogen (BUN) of rats in each group were measured; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe histopathology changes in renal; Transmission electron microscopy was used to observe ultrastructural changes in renal pedicle cells; qRT-PCR and Western blotting were used to detect mRNA and protein expressions of,, α-smooth muscle actin (),, fibroblast specific protein-1 () and IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway related factors.Compared with control group, KI, UACR and BUN in model group were significantly increased (< 0.05); Glomerular hypertrophy, extensive tubular dilatation, epithelial cell degeneration and shedding, fusion or loss of peduncle were observed; Nephrin and P-cadherin expressions in renal were significantly decreased (< 0.05), α-SMA, Desmin and FSP-1 expressions were significantly increased (< 0.05), mRNA and protein expressions of IRS2/PI3K/ FOXO4 signaling pathway related factors were significantly decreased (< 0.05). Compared with model group, KI, UACR and BUN in Compound Xiancao Granules groups were significantly decreased (< 0.05), renal pathological structure and podocyte ultrastructure were significantly improved; Nephrin and P-cadherin expressions in renal were significantly increased (< 0.05), α-SMA, Desmin and FSP-1 expressions were significantly decreased (< 0.05), mRNA and protein expressions of IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway related factors were significantly increased (< 0.05).Compound Xiancao Granules can improve kidney function in DN rats by regulating IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway, inhibit EMT of podocytes in DN rats and reduce podocyte injury.

Compound Xiancao Granules; diabetic nephropathy; podocytes; epithelial-mesenchymal transformation; insulin receptor substrate 2/phosphatidylinositol-3-kinase/forkhead box O4 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6795 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.017

2022-07-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81960913）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)2021年研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目區(qū)級(jí)課題（YCSW2021235）

劉丹寧，碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟疾病研究。Tel: 15878778767 E-mail: 353580454@qq.com

黃國(guó)東，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟疾病研究。Tel: 13768372258 E-mail: 644781538@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]