董利洋，程國良，姚景春，曹天佑，李小鵬，屈會(huì)化，孔 慧*，趙 琰*，張貴民

荊防顆粒對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用研究

董利洋1，程國良1，姚景春2，曹天佑3，李小鵬1，屈會(huì)化4，孔 慧1*，趙 琰1*，張貴民2

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 100029

探究荊防顆粒對(duì)異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、普萘洛爾（10 mg/kg）組和荊防顆粒高、低劑量（32、16 g/kg）組，每組8只。各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)14 d；第13天給藥2 h后，除對(duì)照組外，其余組大鼠皮下多點(diǎn)注射ISO（85 mg/kg），對(duì)照組sc等體積的生理鹽水，連續(xù)2 d。心電圖觀察大鼠ST段的變化；超聲心動(dòng)檢查大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）；取心臟，計(jì)算心臟指數(shù)（heart weight index，HWI）；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理變化；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorinated，TTC）法檢測(cè)心肌梗死面積；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）活性及總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平；采用試劑盒檢測(cè)大鼠心肌組織中超氧化歧物酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原性谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用TUNEL染色法觀察大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況；采用Western blotting檢測(cè)心肌組織中核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高（＜0.01），提示急性心肌梗死模型構(gòu)建成功；EF和FS顯著降低（＜0.01）；血清中LDH、AST、CK-MB活性及TC、TG、LDL-C水平顯著升高（＜0.01）；心肌組織中SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性和GSH水平顯著降低（＜0.01），MDA和ROS水平顯著升高（＜0.01）；心肌組織出現(xiàn)顯著的病理性改變，心肌梗死面積增加（＜0.01），心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加（＜0.01）；心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，荊防顆粒組大鼠EF和FS顯著升高（＜0.05、0.01）；血清中LDH、AST、CK-MB活性及TC、TG、LDL-C水平顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織中SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性和GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01），MDA和ROS水平顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織病理性改變得到顯著改善，心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著降低（＜0.05、0.01）；心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。荊防顆粒通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

荊防顆粒；異丙腎上腺素；急性心肌梗死；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1通路

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），為心肌組織血液供求失衡而導(dǎo)致的心肌缺血性損傷，由于冠狀動(dòng)脈閉塞而導(dǎo)致局部心肌發(fā)生壞死，大量心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。AMI發(fā)生時(shí)，患者會(huì)發(fā)生劇烈的胸骨后疼痛，心肌酶異常升高，嚴(yán)重者常發(fā)生心力衰竭而危及生命[3-4]。異丙腎上腺素是一種β-腎上腺素能受體（β-adrenergic receptor，β-AR）激動(dòng)劑，大劑量注射異丙腎上腺素可引起心肌過度收縮，心率加快，冠脈痙攣而導(dǎo)致心肌持續(xù)缺血缺氧，繼而發(fā)生AMI[5-7]。

AMI可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“胸痹”“真心痛”范疇，中醫(yī)認(rèn)為“胸痹”的病因多為“胸陽不振，氣滯血瘀”，治療多以“溫經(jīng)通陽，行氣活血”為大法[8-9]。荊防顆粒是由古方荊防敗毒散采用現(xiàn)代工藝制備而成的中成藥，方中荊芥、防風(fēng)可宣氣機(jī)于外，柴胡、川芎可暢氣機(jī)于內(nèi)；枳殼、桔梗升降相因；茯苓、川芎血水同治；甘草、茯苓可扶益正氣，諸藥相伍可疏通氣血，改善心臟供血功能，調(diào)整心臟缺氧狀態(tài)。荊防顆粒對(duì)AMI的影響尚未見報(bào)道，本研究通過sc異丙腎上腺素建立大鼠AMI模型，觀察荊防顆粒對(duì)AMI的保護(hù)作用，以期為臨床上荊防顆粒防治AMI提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，9周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SYXK（京）2020-0033。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃，濕度55%～65%，12 h光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2022040802-2009）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號(hào)80022202002）由魯南制藥集團(tuán)股份有限公司提供；鹽酸異丙腎上腺素（批號(hào)901E021）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；鹽酸普萘洛爾（批號(hào)C12151281）購自北京正程生物科技有限公司；大鼠Na+, K+-ATP酶ELISA試劑盒（批號(hào)22061600）、Ca2+, Mg2+-ATP酶ELISA試劑盒（批號(hào)22061696）購自賽譜銳思（北京）科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20220607）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)20220606）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號(hào)20220629）、還原性谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH）試劑盒（批號(hào)20220701）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20220606）購自南京建成生物工程研究所；二甲苯（批號(hào)10023418）購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；TUNEL試劑盒（批號(hào)11684817910）購自Roche公司；抗熒光淬滅封片劑（批號(hào)B0007）；兔源核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2，Nrf2）抗體（批號(hào)ab137536）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體（批號(hào)ab13238）、β-actin抗體（批號(hào)ab8206）；羊抗兔二抗（批號(hào)150016）購自英國Abcam公司；生理鹽水（批號(hào)2202252008）購自石家莊四藥有限公司。

1.3 儀器

FX-7200型全自動(dòng)三通道六導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司）；Vevo 2100型小動(dòng)物超聲儀（Visuai Souics公司）；AU480型全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；HC-2518R型離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DY-2000型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；mμlISKANMK3型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；H-4000型免疫組化筆（上海鑫樂生物科技有限公司）；DS-U3型正置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、普萘洛爾（10 mg/kg）組和荊防顆粒低、高劑量（16、32 g/kg）組，每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。第13天給藥2 h后，模型組和各給藥組大鼠sc鹽酸異丙腎上腺素（85 mg/kg），對(duì)照組sc等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)2 d，以心電圖ST段顯著弓背抬高代表造模成功[10]。

2.2 心臟超聲檢測(cè)

大鼠ip 10%水合氯醛麻醉后備皮固定，通過配備10 MHz線性陣列超聲換能器的Visual Sonics Vevo 2100超高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。分別測(cè)量左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic internal diameter，LVESD）和左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic internal diameter，LVEDD），計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）。

2.3 心臟指數(shù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，取血并分離血清；迅速取出心臟，用冰冷的生理鹽水洗去殘留血液，剪去大血管及結(jié)締組織，用濾紙吸干后稱定質(zhì)量，于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，?jì)算心臟指數(shù)。

心臟指數(shù)＝心臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 心肌組織病理學(xué)觀察

各組大鼠心臟于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠心臟組織的病理變化。

2.5 心肌梗死率測(cè)定

取各組大鼠心臟，垂直于心臟長軸方向?qū)⒆笮氖覚M斷切成5片，置入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorinated，TTC）溶液中，37 ℃避光孵育15 min。灰白色為梗死區(qū)（infarcted areas，IS），紅色為非梗死區(qū)（non-infarcted areas，NIS），計(jì)算心肌梗死率。

心肌梗死率＝梗死區(qū)域面積/左心室面積

2.6 血清心肌酶活性和血脂水平的檢測(cè)

各組大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）活性及總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。

2.7 心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的檢測(cè)

取各組大鼠心肌組織，勻漿后取上清液，按照試劑盒說明書測(cè)定SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性及MDA、GSH、ROS水平。

2.8 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

取各組大鼠心肌組織，于4%多聚甲醛中固定，雙蒸水沖洗，石蠟包埋，制備厚度為2～3 μm的切片，滴加TUNEL反應(yīng)液孵育60 min，滴加DAPI覆蓋細(xì)胞以復(fù)染核，滴加抗熒光淬滅劑封片，于顯微鏡下觀察凋亡陽性細(xì)胞，并計(jì)算凋亡率。

凋亡率＝TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)

2.9 Western blotting檢測(cè)心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)

取各組大鼠心肌組織，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封閉，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入二抗，于37 ℃孵育120 min，TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光試劑顯色，使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心電圖參數(shù)的影響

在麻醉狀態(tài)下對(duì)大鼠進(jìn)行心電圖檢測(cè)，如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠ST段顯著升高（＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，各給藥組大鼠ST段均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒對(duì)AMI大鼠的心臟具有保護(hù)作用。

3.2 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心臟功能的影響

超聲心動(dòng)是檢測(cè)大鼠心臟功能的重要指標(biāo)。如圖2和表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的EF和FS顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠EF和FS均顯著升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心臟功能的影響

表1 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心臟功能的影響(, n = 8)

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.3 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心臟形態(tài)及心臟指數(shù)的影響

如圖3所示，對(duì)照組大鼠心臟外觀表面光滑，色澤紅潤；模型組大鼠顏色灰白，心尖區(qū)可見明顯的缺血灶；各給藥組大鼠心臟外觀紅潤光滑，表明荊防顆?？娠@著改善心肌缺血。與對(duì)照組比較，模型組大鼠心臟指數(shù)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心臟指數(shù)顯著降低（＜0.01）。

3.4 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織病理變化的影響

如圖4所示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密，未見炎性細(xì)胞浸潤和充血水腫；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤和不同程度的心肌細(xì)胞壞死，且有明顯的膠原纖維和結(jié)締組織增生；普萘洛爾組大鼠心肌細(xì)胞排列較為有序，可看到較多的炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫變形；荊防顆粒高、低劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，部分心肌細(xì)胞增大，有少量的炎性細(xì)胞浸潤，心肌纖維化較模型組明顯改善。表明荊防顆?？捎行Ц纳汽}酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌組織病理變化。

圖3 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心臟形態(tài)(A) 及心臟指數(shù)(B) 的影響(, n = 8)

圖4 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織病理變化的影響 (HE,×200)

3.5 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌梗死面積的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌梗死率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌梗死率均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖5 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌梗死率的影響(, n = 5)

3.6 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠血清中LDH、AST、CK-MB活性及LDL、HDL、TC、TG水平的影響

如表2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒能在一定程度上減輕心肌損傷程度。

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中LDL-C、TC和TG水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01），表明造模后機(jī)體出現(xiàn)血脂異常狀態(tài)；與模型組比較，各給藥組血清中LDL-C、TC和TG水平均顯著降低（＜0.05、0.01），HDL-C水平顯著升高（＜0.01）。表明荊防顆粒能有效減輕AMI大鼠血清中血脂異常狀態(tài)。

3.7 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平的影響

氧化應(yīng)激是AMI發(fā)病的重要機(jī)制之一，通過測(cè)定各組大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平來反映機(jī)體的氧化應(yīng)激程度。如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD、CAT活性及GSH水平顯著降低（＜0.01），表明機(jī)體過氧化程度加重。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中ROS和MDA水平顯著降低（＜0.05、0.01），SOD、CAT活性及GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能夠降低AMI大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激水平，提高機(jī)體抗氧化能力的水平。

3.8 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影響

Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的重要酶，其含量的高低可間接反映心肌細(xì)胞的損傷程度。如表5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均顯著升高（＜0.01）。表明荊防顆?？捎行Щ謴?fù)AMI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性，減輕心肌損傷。

表2 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性的影響(, n = 8)

表3 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC和TG水平的影響(, n = 8)

表4 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平的影響(, n = 8)

表5 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影響(, n = 8)

3.9 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01），提示機(jī)體造模后細(xì)胞凋亡程度增加；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率均顯著降低（＜0.01）。表明荊防顆粒能夠有效減輕AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

3.10 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。表明荊防顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控Nrf2/HO-1通路來減輕機(jī)體氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平，減輕心肌缺血損傷。

圖6 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響(, n = 5)

圖7 荊防顆粒對(duì)AMI大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

AMI是臨床常見的一種急性缺血性心臟病，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[11]。目前AMI的主要治療手段是血管成形術(shù)和溶栓治療后對(duì)缺血區(qū)域進(jìn)行再灌注，然而血運(yùn)重建法對(duì)心肌細(xì)胞可造成進(jìn)一步的損傷，嚴(yán)重者可誘發(fā)心力衰竭，這需要尋找新的預(yù)防和治療AMI的藥物。異丙腎上腺素是一種合成的兒茶酚胺[12]，其誘發(fā)的AMI模型與臨床患者發(fā)病相似，且具有簡單方便、動(dòng)物死亡率低、模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此異丙腎上腺素誘導(dǎo)的AMI可作為用于心臟保護(hù)藥物的開發(fā)和研究的標(biāo)準(zhǔn)化模型[13]。

AMI可歸類為中醫(yī)“胸痹”范疇，治療以“溫經(jīng)散寒，理氣活血”為主。荊防敗毒散[14]首載于明代張時(shí)徹《攝生眾妙方》，方中荊、防與二活開表透外；前、柴二胡樞利出入氣機(jī)；枳殼、桔梗提壺揭蓋，升降上下之氣機(jī)；茯苓、甘草補(bǔ)脾利水以安五臟，諸藥合用可以促進(jìn)氣機(jī)流轉(zhuǎn)，開上導(dǎo)下，升清降濁，推動(dòng)臟腑的新陳代謝，可有效緩解人體氣血瘀滯狀態(tài)，對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)了荊防敗毒散具有很好的活血化瘀、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，已廣泛應(yīng)用于治療外感內(nèi)傷各科疾病[15]。

在心臟疾病中，心電圖是臨床最常用的檢測(cè)手段，當(dāng)AMI發(fā)生時(shí)，會(huì)出現(xiàn)心電圖ST段的特異性改變，故ST段的變化幅度可基本反映心肌梗死的嚴(yán)重程度。超聲心動(dòng)也是檢測(cè)心臟功能的重要手段，超聲心動(dòng)中的EF和FS常作為心臟功能檢測(cè)的重要指標(biāo)，當(dāng)心肌發(fā)生缺血損傷時(shí)，EF和FS會(huì)低于正常值。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心電圖ST段顯著抬高（＞0.2 mV），EF和FS顯著降低；荊防顆?？娠@著降低心電圖ST段的抬高，并明顯升高了EF、FS值，表明荊防顆粒具有正向肌力作用，可減少異丙腎上腺素對(duì)心肌的損傷。

當(dāng)心肌發(fā)生缺血梗死時(shí)，心肌細(xì)胞膜遭到破壞而使心肌酶釋放到血液中，其中CK-MB、LDH和AST活性可以反映缺血損傷的程度。此外，血脂異常是心肌梗死發(fā)病最常見的危險(xiǎn)因素，脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜的沉積，進(jìn)而促進(jìn)心肌梗死的發(fā)生[16-17]。能量供應(yīng)不足是心肌細(xì)胞損傷的重要因素，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可使心肌收縮力和需氧量增加，心肌的過度收縮可導(dǎo)致ATP降解，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[18]。心肌細(xì)胞膜上的鈉鉀泵和鈣鎂泵在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度方面具有重要作用[19]，其活性降低可引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞的凋亡，異丙腎上腺素可通過激活腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（adenylate cyclase-adenosine cyclophosphate-protein kinase A，AC-cAMP-PKA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而介導(dǎo)鈣通道的磷酸化，進(jìn)而使Ca2+內(nèi)流增加導(dǎo)致鈣超載。本研究發(fā)現(xiàn)荊防顆?？梢越档脱逯行募?biāo)志酶（CK-MB、LDH、AST）活性和TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，并且增加Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性來發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在AMI發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，大劑量重復(fù)使用異丙腎上腺素會(huì)誘導(dǎo)自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，從而通過缺氧、鈣超載和心肌細(xì)胞膜丟失來增強(qiáng)心肌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20-21]。心肌細(xì)胞在病理過程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，對(duì)細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷，并最終導(dǎo)致能量代謝發(fā)生變化，繼而引起細(xì)胞壞死和凋亡[22]。MDA是ROS的一種穩(wěn)定代謝物，是作為多不飽和脂肪酸過氧化而產(chǎn)生的一種氧化應(yīng)激標(biāo)志物，急性缺血損傷引起的低氧水平和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致MDA在心肌中積累[23]。SOD、MDA、GSH和CAT等自由基清除酶是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，SOD通常存在于質(zhì)膜中，其活性降低是氧化應(yīng)激的顯著標(biāo)志。GSH通過減少過氧化氫和脂質(zhì)過氧化來保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷。CAT是一種四聚體血紅蛋白，可作為去除過氧化氫的催化劑。本研究結(jié)果顯示，荊防顆粒顯著增加心肌組織中SOD、CAT活性及GSH水平，降低ROS和MDA水平，說明荊防顆?？梢蕴岣唧w內(nèi)抗氧化酶活性，對(duì)抗自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)缺血心肌細(xì)胞[24-25]。

細(xì)胞凋亡是異丙腎上腺素誘導(dǎo)AMI的主要病理機(jī)制，可導(dǎo)致缺血區(qū)和缺血邊界的心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)而發(fā)展為AMI，并最終引發(fā)心力衰竭[26]。細(xì)胞凋亡是由多基因控制，通過信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的復(fù)雜過程。多項(xiàng)研究表明，Nrf2/HO-1是維持心肌細(xì)胞氧化還原穩(wěn)定的重要信號(hào)通路。Nrf2是一種與氧化還原相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)氧化損傷有保護(hù)作用。在生理狀態(tài)下，Nrf2與其抑制劑Keap1作為異二聚體結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)中，在缺血缺氧條件下，Nrf2與Keap1分離后進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidant response element，ARE）結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)HO-1及相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，荊防顆粒可顯著降低AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡，上調(diào)心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平，表明荊防顆?？梢约せ頝rf2/HO-1通路，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血損傷。

綜上所述，荊防顆粒能夠通過減少心肌梗死面積、降低心肌酶活性、增加自由基清除酶活性、抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)急性缺血心肌損傷的預(yù)防性保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能為通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路來調(diào)控氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of Jingfang Granules on acute myocardial infarction induced by isoproterenol in rats

DONG Li-yang1, CHENG Guo-liang1, YAO Jing-chun2, CAO Tian-you3, LI Xiao-peng1, QU Hui-hua4, KONG Hui1, ZHAO Yan1, ZHANG Gui-min2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. State Key Laboratory of Generic Technology of Traditional Chinese Medicine Pharmaceuticals, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China 3. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 4. Institute of Chinese Medicine Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore the protective effect of Jingfang Granules (荊防顆粒) on isoproterenol (ISO)-induced acute myocardial infarction in rats.SD rats were randomly divided into control group, model group, propranolol (10 mg/kg) group and Jingfang Granules high-, low-dose (32, 16 g/kg) groups, with 8 rats in each group. Rats in each administration group were ig corresponding drugs once a day for 14 d, 2 h after administration on 13th day, except for control group, rats in other groups were sc ISO (85 mg/kg) at multiple points, and control group was sc same volume physiological saline for two consecutive days. Electrocardiogram was used to observe the changes of ST segment. Left ventricular ejection fraction (EF) and fractional shortening (FS) were examined by echocardiography. Hearts were collected and heart weight index (HWI) was calculated. Pathological changes of myocardium were observed by hematoxylin eosin (HE) staining; Infarct size was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) method; Activities of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase isoenzyme (CK-MB), aspartate aminotransferase (AST) and levels of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in serum were detected by automatic biochemical analyzer; Activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), Na+, K+-ATP, Ca2+, Mg2+-ATP and levels of malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase (GSH), reactive oxygen species (ROS) in myocardium of rats were measured by kit; TUNEL staining was used to observe the apoptosis of myocardial cells in rats; Nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) protein expressions in myocardium were detected by Western blotting.Compared with control group, ST segment in lead II of Electrocardiogram in model group was elevated upward (< 0.01), indicating that the model of acute myocardial infarction was successfully constructed; EF and FS were significantly decreased (< 0.01); Activities of LDH, AST, CK-MB and levels of TC, TG, LDL-C in serum were significantly increased (< 0.01); Activities of SOD, CAT, Na+, K+-ATPase, Ca2+, Mg2+-ATPase and level of GSH in myocardium were significantly decreased (< 0.01), while the levels of MDA and ROS were increased (< 0.01); Myocardial tissue showed significant pathological changes, myocardial infarction area was increased (< 0.01), apoptosis of myocardial cells were significantly increased (< 0.01); Nrf2 and HO-1 protein expressions in myocardium were significantly decreased (< 0.01). Compared with model group, EF and FS in Jingfang Granules group were significantly increased (< 0.05, 0.01); Activities of LDH, AST, CK-MB and levels of TC, TG, LDL-C in serum were decreased (< 0.05, 0.01); Activities of SOD, CAT, Na+, K+-ATP, Ca2+, Mg2+-ATP and level of GSH in myocardium were significantly increased (< 0.05, 0.01), while the levels of MDA and ROS were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Pathological changes of myocardial tissue were significantly improved, myocardial infarction area and apoptosis of myocardial cells were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Nrf2 and HO-1 protein expressions in myocardium were significantly increased (< 0.05, 0.01).Jingfang Granules can protect the heart by inhibiting apoptosis of myocardial cells and oxidative stress injury.

JingFang Granules; isoproterenol; acute myocardial infarction; oxidative stress; cell apoptosis; nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2/heme oxygenase-1 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6785 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.016

2022-08-28

荊防顆粒二次開發(fā)（2180071720113）

董利洋，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。E-mail: dly1613@163.com

孔 慧（1976—），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向?yàn)榻?jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。Tel: (010)64286705 E-mail: doris7629@126.com

趙 琰（1973—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)榻?jīng)方的現(xiàn)代應(yīng)用。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]