衡依然，段慧竹，杜 鶴，閆 艷，杜晨暉*

酸棗仁總皂苷改善對(duì)氯苯丙氨酸誘導(dǎo)失眠大鼠模型學(xué)習(xí)記憶損傷機(jī)制的研究

衡依然1，段慧竹1，杜 鶴1，閆 艷2*，杜晨暉1*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619 2. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

基于代謝組學(xué)技術(shù)考察酸棗仁總皂苷（total saponins of，SZSS）對(duì)失眠大鼠內(nèi)源性代謝物的影響，并探討酸棗仁總皂苷改善學(xué)習(xí)記憶的藥效及其作用機(jī)制。采用對(duì)氯苯丙氨酸（-4-chlorophenylalanine，PCPA）誘導(dǎo)大鼠失眠模型，給予地西泮和酸棗仁總皂苷干預(yù)后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察海馬組織病理變化；采用ELISA測(cè)定海馬組織5-羥色氨（5-hydroxytryptamine，5-HT）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）及NO（nitric oxide，NO）水平。利用UPLC-Orbitrap-MS/MS技術(shù)對(duì)大鼠海馬組織代謝輪廓進(jìn)行分析，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析篩選差異性代謝物，并基于MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路及代謝網(wǎng)絡(luò)分析，多角度探討酸棗仁總皂苷改善學(xué)習(xí)記憶的代謝特征及作用途徑。與模型組比較，酸棗仁總皂苷組大鼠學(xué)習(xí)能力顯著提高（＜0.05、0.01），海馬組織病理結(jié)構(gòu)明顯改善，海馬組織中5-HT、GABA及NO水平顯著升高（＜0.05、0.01）；代謝組學(xué)共鑒定出18種與學(xué)習(xí)記憶損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，酸棗仁總皂苷主要通過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等7條主要氨基酸代謝通路發(fā)揮改善記憶損傷的作用。酸棗仁總皂苷能夠通過回調(diào)海馬組織內(nèi)源性差異代謝物，并調(diào)控相關(guān)氨基酸代謝通路，從而改善失眠引起學(xué)習(xí)記憶減退。

酸棗仁總皂苷；失眠；學(xué)習(xí)記憶；海馬；差異代謝物

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Millvar.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，具有補(bǔ)肝、寧心、斂汗、生津的功效[1]。酸棗仁中主要含有皂苷、黃酮、脂肪油和揮發(fā)油等多種成分。其中，酸棗仁皂苷是酸棗仁中含量較高、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜及藥理作用廣泛的一類有效成分[2-3]。目前已從酸棗仁中鑒定到31種皂苷類成分[4]，主要有達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷和齊墩果烷型、羽扇豆烷型、ceanothane型等五環(huán)三萜類皂苷。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，酸棗仁皂苷是酸棗仁發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神作用的主要藥效成分，在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等方面亦表現(xiàn)出廣泛的藥理活性[5-11]。

失眠在睡眠障礙的分類中占主導(dǎo)地位，并在近年來成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共問題，根據(jù)我國睡眠研究會(huì)公布的最新調(diào)查結(jié)果顯示，2022年中國成年人的失眠發(fā)生率高達(dá)38.2%[12]。失眠會(huì)影響學(xué)習(xí)記憶的形成和鞏固，并引發(fā)焦慮、抑郁等精神疾病，嚴(yán)重影響工作和生活[13-15]。研究表明，失眠通過影響海馬結(jié)構(gòu)及神經(jīng)遞質(zhì)的水平進(jìn)而影響海馬神經(jīng)可塑性[16]，造成學(xué)習(xí)記憶損傷；失眠通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制海馬中抗氧化酶的生成、活性氧的過度增加、脂質(zhì)過氧化和DNA修飾等生理或病理過程而引起神經(jīng)元損傷，間接造成學(xué)習(xí)記憶損傷[17]；失眠可通過激活海馬中炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)損傷，進(jìn)而造成學(xué)習(xí)記憶損傷[18]。海馬對(duì)睡眠覺醒也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。達(dá)瑪烷型皂苷如人參皂苷[20-21]、知母皂苷[22]、三七皂苷[23]等均能夠改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，酸棗仁皂苷類成分能夠改善癡呆[24]、阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）[25]等動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力，但對(duì)于失眠引起的學(xué)習(xí)記憶能力減退研究未見報(bào)道。酸棗仁皂苷能否改善失眠導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶損傷，并且如何發(fā)揮作用值得進(jìn)一步研究。

對(duì)氯苯丙氨酸（-4-chlorophenylalanine，PCPA）失眠模型是評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)靜催眠作用中最常用的誘導(dǎo)睡眠障礙藥理模型[26-27]。PCPA是一種特異的、不可逆的色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）抑制劑，TPH是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）生物合成的限速酶。色氨酸可經(jīng)TPH催化生成5-羥色氨酸（5-hydroxytryptamine，5-HTA），5-HTA進(jìn)一步脫羧生成5-HT。因此，ip PCPA會(huì)抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成[28]，從而導(dǎo)致動(dòng)物外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT水平顯著降低，晝夜節(jié)律消失，幾乎完全失眠[29]。5-HT是與睡眠關(guān)系最密切的神經(jīng)遞質(zhì)之一，在慢波睡眠誘導(dǎo)和維持中具有重要作用[30]。目前以5-HT水平的顯著變化作為PCPA失眠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)在文獻(xiàn)中較為常見[31-34]。海馬區(qū)是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最復(fù)雜的部位，主要參與機(jī)體近期記憶中的情節(jié)記憶及空間位置的學(xué)習(xí)[35]。外源性注射PCPA后，海馬結(jié)構(gòu)受到損傷，引起單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（5-HT、去甲腎上腺素、多巴胺等）、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)[γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸等]及與記憶相關(guān)的細(xì)胞因子[一氧化氮（nitric oxide，NO）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α等]水平變化[36]，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷[37]。

近年來，代謝組學(xué)作為一種新型技術(shù)手段，能夠更加可靠、靈敏地反映疾病或藥物作用引起的機(jī)體生物功能變化，篩選調(diào)節(jié)機(jī)體的潛在生物標(biāo)志物。孟喜勝等[38]對(duì)恒清II號(hào)方干預(yù)的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其抗AD作用及改善認(rèn)知障礙與氨基酸生物合成和代謝通路相關(guān)。邵曉妮等[39]基于1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)高尿酸血癥認(rèn)知功能障礙大鼠的皮層和海馬進(jìn)行檢測(cè)，分析其誘發(fā)認(rèn)知功能障礙機(jī)制可能與能量代謝的糖酵解和三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝等有關(guān)。目前代謝組學(xué)已被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，包括疾病的診斷和機(jī)制研究、尋找藥物作用靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物等研究[40]。

為深入探討酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及其機(jī)制，本研究復(fù)制PCPA失眠大鼠模型，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總路程、靜止時(shí)間及血清中5-HT水平評(píng)價(jià)失眠模型；通過逃逸潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間、目標(biāo)象限總路程、平均速度、進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)等水迷宮行為學(xué)指標(biāo)、海馬組織生理病理結(jié)構(gòu)變化及海馬中神經(jīng)遞質(zhì)含量，評(píng)價(jià)酸棗仁總皂苷改善PCPA失眠引起的大鼠學(xué)習(xí)記憶減退作用，結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)多角度探索酸棗仁總皂苷改善學(xué)習(xí)記憶損傷的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于濕度（50±10）%、溫度（25±2）℃、12 h晝夜循環(huán)的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水，給藥前禁食12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2021DW172）。

1.2 藥品與試劑

酸棗仁總皂苷為本課題組制備，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.75%[38]；PCPA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)GK01-QHLL）購自梯希愛（上海）生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)P11011）購自德國默克公司；地西泮（批號(hào)1901023203）購自山東信誼制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號(hào)J0713A）購自大連美侖生物科技有限公司；生理鹽水（批號(hào)1901023203）購自邦標(biāo)醫(yī)療科技有限公司；5-HT ELISA試劑盒（批號(hào)20211110）、GABA ELISA試劑盒（批號(hào)20211105）、NO ELISA試劑盒（批號(hào)2021021）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲醇和甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

U3000型超高效液相色譜儀、ExactiveTMOrbitrap質(zhì)譜儀、88880018型渦旋儀、DNA120-230型離心濃縮儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；MMT-200型大鼠水迷宮測(cè)試儀（成都泰盟軟件有限公司）；OFT-100型自主活動(dòng)測(cè)試儀（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶藥效學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 PCPA失眠模型的建立

（1）PCPA懸浮液的制備：用pH 7～8的堿性生理鹽水配制200 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，少量多次地加入PCPA粉末中，不斷攪拌，制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的懸浮液。

（2）PCPA失眠大鼠模型的復(fù)制：取48只SD大鼠，每日8: 00—9: 30時(shí)ip PCPA溶液（400 mg/kg），連續(xù)注射4 d。另取12只大鼠作為對(duì)照組。造模第3天眼眶取血，每組隨機(jī)取6只。血樣于4 ℃靜置30 min，3500 r/min離心10 min，得血清樣品，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定正常大鼠與造模后大鼠血清中5-HT水平，模型大鼠血清中5-HT水平顯著低于正常大鼠（＜0.001），表明PCPA大鼠失眠模型制備成功。

2.1.2 分組及給藥 造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、地西泮（2 mg/kg）組和酸棗仁總皂苷低、高劑量（10、20 g/kg）組，每組12只。每日8: 00—9: 00時(shí)，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

2.1.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 給藥第3天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，在給藥30 min后將大鼠放置于中心區(qū)域進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試時(shí)間6 min。前1 min為適應(yīng)期，記錄5 min內(nèi)大鼠總路程和靜止時(shí)間。

2.1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥第4天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在黑色內(nèi)壁的圓形水池中進(jìn)行，水池等分為4個(gè)象限（平面直角坐標(biāo)系中里的橫軸和縱軸所劃分的4個(gè)區(qū)域，右上的稱為第I象限，左上的稱為第II象限，左下的稱為第III象限，右下的稱為第IV象限），目標(biāo)平臺(tái)位于第IV象限水面下1 cm。水溫恒定（22±2）℃，光線恒定，無日光變化影響。實(shí)驗(yàn)過程采用視頻跟蹤分析系統(tǒng)進(jìn)行記錄。

（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：選擇離目標(biāo)平臺(tái)的最遠(yuǎn)方位（第II象限）固定位點(diǎn)將大鼠面朝內(nèi)壁放入水中，記錄各組大鼠從進(jìn)入水中到找到并爬上目標(biāo)平臺(tái)停留15 s所用的時(shí)間，即大鼠的逃避潛伏期。若大鼠在90 s內(nèi)沒有找到目標(biāo)平臺(tái)，則對(duì)其進(jìn)行引導(dǎo)，并在平臺(tái)上停留15 s，所有大鼠每天訓(xùn)練2次，持續(xù)2 d。

（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：撤去平臺(tái)，將各組大鼠在同一位置面向池內(nèi)壁放入水中，記錄大鼠在60 s內(nèi)行動(dòng)軌跡圖、游泳速度及其穿越目標(biāo)象限的次數(shù)、時(shí)間、路程。

2.1.5 大鼠取材與處理 末次給藥1 h后，各組大鼠ip 10%戊巴比妥鈉麻醉后處死，斷頭，經(jīng)顱前正中線剪開頭皮，小心撬開顱骨，在冰盒上取下大鼠腦組織，剝離海馬，放入4%多聚甲醛固定液中，每組3份。經(jīng)石蠟切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)海馬組織進(jìn)行病理觀察并采集圖像。各組剩余大鼠海馬樣品，稱定質(zhì)量后加入10倍量生理鹽水，4 ℃勻漿180 s，3000 r/min離心15 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定海馬組織中5-HT、GABA和NO水平。

2.2 海馬組織代謝組學(xué)分析

2.2.1 海馬組織樣品的處理 精密稱取“2.1.5”項(xiàng)下的對(duì)照組、模型組、地西泮組和酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠海馬組織30 mg，加入300 μL預(yù)冷的含0.1%甲酸的甲醇溶液，4 ℃勻漿3 min（頻率60 Hz），4 ℃離心10 min，取上清液250 μL置于離心濃縮儀中濃縮至干。加入100 μL 70%甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋使完全溶解，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行分析。

2.2.2 質(zhì)控樣品的處理 取20 μL各組海馬組織樣品溶液混合作為質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品在運(yùn)行之前、樣品組間和運(yùn)行之后進(jìn)樣，以評(píng)估整個(gè)分析過程的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.2.3 色譜條件 Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，2% B；1～3 min，2%～50% B；3～14 min，50%～60% B；14～18 min，60%～90% B；18～19 min，90%～100% B；19～20 min，100% B；20～22 min，100%～2% B。柱溫50 ℃；體積流量0.35 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.4 質(zhì)譜條件 ESI離子源；正、負(fù)離子掃描；掃描模式Full MS/dd MS2；鞘氣體積流量35 arb（ESI+）、35 arb（ESI?）；輔助氣體積流量10 arb（ESI+）、10 arb（ESI?）；噴霧電壓3.5 kV（ESI+）、2.5 kV（ESI?）；毛細(xì)管溫度320 ℃；離子源溫度350 ℃（ESI+）、300 ℃（ESI?）；一級(jí)全掃描分辨率70 000、二級(jí)掃描分辨率為17 500；掃描范圍/100～1500；動(dòng)態(tài)排除持續(xù)時(shí)間8 s；NCE能量分別設(shè)為20、30、50 V。

2.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS數(shù)據(jù)收集完畢后，導(dǎo)出raw格式文件，采用Compound Discoverer 3.3軟件進(jìn)行圖譜對(duì)比查看、去噪音、解卷積和歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理，導(dǎo)出csv格式的二維數(shù)據(jù)矩陣，包括/、保留時(shí)間和峰面積。使用SIMCA-P 14.1軟件對(duì)處理數(shù)據(jù)依次進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），根據(jù)VIP＞1及＜0.05篩選出潛在代謝標(biāo)記物，將篩選的差異代謝物導(dǎo)入Metabo Analyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行高通量代謝通路分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠總路程顯著增加（＜0.01），靜止時(shí)間顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠總路程顯著降低（＜0.01、0.001），靜止時(shí)間顯著升高（＜0.05、0.01），表明酸棗仁總皂苷具有鎮(zhèn)靜催眠的作用。

3.2 Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以逃避潛伏期為指標(biāo)評(píng)價(jià)失眠大鼠空間學(xué)習(xí)能力。在經(jīng)過4次的引導(dǎo)訓(xùn)練后，各組大鼠逃避潛伏期均有不同程度的下降，第4次訓(xùn)練即最終定位航行測(cè)試結(jié)果，見圖2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，地西泮組和酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠逃避潛伏期顯著降低（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

圖2 酸棗仁總皂苷對(duì)失眠大鼠定位巡航能力的影響(, n = 8)

3.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 采用大鼠水迷宮測(cè)試儀跟蹤成像系統(tǒng)對(duì)各組大鼠在水池中的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行記錄，見圖3。原平臺(tái)所在象限為第IV象限，對(duì)照組大鼠入水后能夠自主地去第IV象限尋找平臺(tái)，軌跡較為松散；模型組大鼠的軌跡集中分布在入水的第I象限內(nèi)，較少去探索其他象限；地西泮組大鼠入水后活動(dòng)減少，出現(xiàn)靜止漂浮水面的現(xiàn)象，個(gè)別大鼠在水中無規(guī)律的運(yùn)動(dòng)；酸棗仁總皂苷低、高劑量組大鼠在平臺(tái)所在的第IV象限內(nèi)徘徊，并在入水后有直線進(jìn)入第IV象限的趨勢(shì)，提示給予酸棗仁總皂苷后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有所回調(diào)。

圖3 各組大鼠Morris水迷宮運(yùn)動(dòng)軌跡圖

利用GraphPad Prism軟件對(duì)目標(biāo)象限停留時(shí)間、進(jìn)入目標(biāo)象限路程、平均速度和進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠在撤去平臺(tái)后進(jìn)入第IV象限時(shí)間、路程、次數(shù)及平均速度均顯著降低（＜0.01），在實(shí)驗(yàn)中觀察到其多在入水處徘徊或無目的的探索情況；與模型組比較，各給藥組大鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的路程、停留時(shí)間、次數(shù)及平均速度均顯著延長(zhǎng)（＜0.05、0.01），表明酸棗仁總皂苷能夠改善失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.3 大鼠海馬病理切片結(jié)果

如圖5所示，模型組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯損傷，在海馬齒狀回區(qū)胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重，同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，可能影響到信號(hào)的傳導(dǎo)及神經(jīng)元的產(chǎn)生。與模型組相比較，各給藥組大鼠海馬胞質(zhì)空泡化損傷均有不同程度改善，但仍存在神經(jīng)元萎縮現(xiàn)象，酸棗仁總皂苷低劑量組大鼠海馬切片較為接近對(duì)照組，與行為學(xué)結(jié)果一致。

圖4 酸棗仁總皂苷對(duì)失眠大鼠空間探索能力的影響(, n = 8)

黑色箭頭表示胞核胞質(zhì)分界不清，黃色箭頭表示神經(jīng)元胞質(zhì)空泡化

3.4 酸棗仁總皂苷對(duì)失眠大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬組織中5-HT、GABA和NO水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.5 海馬代謝組學(xué)研究結(jié)果

3.5.1 海馬組織樣品液質(zhì)輪廓分析 為考察各組大鼠體內(nèi)代謝組學(xué)的整體變化，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，采用SIMCA-P軟件對(duì)海馬組織樣品進(jìn)行PCA分析，在正、負(fù)離子模式下質(zhì)控樣品中分別有100%、99%峰的RSD值＜30%，表明該方法有較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，數(shù)據(jù)可靠。如圖7所示，正、負(fù)離子模式下對(duì)照組與模型組明顯分開，且組間距離較遠(yuǎn)，表明模型組與對(duì)照組大鼠的內(nèi)源性代謝物存在較大差異，而各給藥組均可回調(diào)這種差異。

3.5.2 潛在標(biāo)志物預(yù)測(cè)分析 為了對(duì)比酸棗仁總皂苷對(duì)大鼠海馬組織樣品內(nèi)源性代謝物的影響，進(jìn)一步對(duì)對(duì)照組和模型組、模型組和酸棗仁總皂苷低劑量組進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，結(jié)合VIP＞1、＜0.05篩選潛在生物標(biāo)志物的候選變量。圖8-A、B為對(duì)照組和模型組的OPLS-DA圖，2組可沿X軸明顯分開，組間差異較大，表明模型組大鼠代謝輪廓發(fā)生改變，即在正、負(fù)離子模式下，ip PCPA顯著影響了大鼠海馬中的內(nèi)源性代謝物。200次模型驗(yàn)證結(jié)果表明（正離子模式下2＝0.996、2＝0.954，負(fù)離子模式下2＝0.996、2＝0.967），模型可靠，具有良好的預(yù)測(cè)能力，可用于后續(xù)差異代謝物的篩選。S-plot圖中紅色點(diǎn)即為VIP＞1的代謝物，表明這些代謝物對(duì)組間貢獻(xiàn)度較大，可能是兩組間的差異代謝物。同時(shí)對(duì)模型組和酸棗仁總皂苷低劑量組進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果見圖8-C、D。

圖6 酸棗仁總皂苷對(duì)失眠大鼠海馬組織中5-HT、GABA和NO水平的影響(, n = 6)

圖7 正 (A)、負(fù)(B) 離子模式下各組大鼠海馬樣品PCA分析

圖8 正 (A, C)、負(fù)離子 (B, D) 模式下各組大鼠海馬樣品的OPLS-DA得分圖、模型驗(yàn)證圖及S-plot圖

3.5.3 海馬組織樣品差異代謝物的確定 將篩選得到的差異性代謝物與mzcloud、mzvault、HMDB等數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物信息進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出18個(gè)差異代謝物。為了進(jìn)一步分析模型組及各給藥組海馬組織樣品中18個(gè)內(nèi)源性差異代謝物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，將各組差異性代謝物的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad軟件繪制箱圖，結(jié)果見圖9。與對(duì)照組比較，模型組10種氨基酸類（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、焦谷氨酸、蘇氨酸）及2種酰胺類（谷氨酰胺、油酰胺）和其他類（二芐胺、膽堿、肌苷、胞嘧啶）共16種代謝物含量均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2種差異代謝物含量顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，酸棗仁總皂苷低劑量組10種氨基酸、2種酰胺類代謝物和肌苷、胞嘧啶共14種差異代謝物含量顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001），十六酰胺、十八烯酸2種差異代謝物含量顯著下調(diào)（＜0.05、0.001）。

3.5.4 代謝通路分析 將酸棗仁總皂苷顯著回調(diào)的16種差異代謝物（精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、焦谷氨酸、蘇氨酸、油酰胺、谷氨酰胺、肌苷、胞嘧啶、十六酰胺、十八烯酸）分別導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)處理中心進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路富集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，基于拓?fù)浞治鲞M(jìn)行權(quán)重計(jì)算，通過對(duì)值、Holm、誤判率（FDR）及通路影響值的綜合分析，得到代謝通路富集氣泡圖，結(jié)果見圖10。酸棗仁總皂苷可通過7條主要代謝通路調(diào)控大鼠海馬代謝，最重要的是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝通路，其通路影響值可達(dá)到1。其余比較關(guān)鍵的代謝通路按通路影響值由高到低排列依次為苯丙氨酸代謝、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。本研究中所涉及到的代謝通路均是氨基酸代謝通路，提示酸棗仁總皂苷能夠調(diào)控海馬組織中氨基酸代謝水平。

圖9 各組大鼠海馬樣品差異代謝物的相對(duì)含量(, n = 6)

圖10 酸棗仁總皂苷調(diào)控的代謝通路圖

代謝組學(xué)結(jié)果表明，酸棗仁總皂苷能夠通過多種途徑調(diào)控失眠大鼠體內(nèi)異常代謝，主要涉及到7條主要相關(guān)氨基酸代謝通路，為了進(jìn)一步明確酸棗仁總皂苷在體內(nèi)代謝機(jī)制，結(jié)合KEGG及相關(guān)富集分析方法，繪制代謝途徑網(wǎng)絡(luò)圖，見圖11。

4 討論

本研究建立PCPA大鼠失眠模型，利用曠場(chǎng)及Morris水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)酸棗仁總皂苷對(duì)學(xué)習(xí)記憶損傷的藥效作用，采用HE染色法觀察大鼠海馬組織病理變化，ELISA測(cè)定海馬組織中5-HT、GABA及NO水平，并結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)大鼠海馬組織代謝輪廓進(jìn)行分析，采用多元統(tǒng)計(jì)分析篩選差異性代謝物，基于MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路及代謝網(wǎng)絡(luò)分析，從多角度探索酸棗仁總皂苷改善失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的作用途徑。

紫色為氨基酸，綠色為神經(jīng)遞質(zhì)及激素類物質(zhì)，紅色箭頭為酸棗仁總皂苷顯著上調(diào)的內(nèi)源性物質(zhì)

研究表明，慢波睡眠與快速眼動(dòng)睡眠能夠鞏固學(xué)習(xí)記憶的形成，且與神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化有關(guān)[41]。5-HT能夠參與機(jī)體睡眠-覺醒過程，并且與動(dòng)物覺醒呈正相關(guān)，對(duì)慢波睡眠的發(fā)生和維持起著重要作用[42]，5-HT水平升高有利于維持睡眠狀態(tài)[43]，本研究結(jié)果顯示，酸棗仁總皂苷可通過上調(diào)海馬組織中5-HT水平維持睡眠狀態(tài)。GABA是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可阻斷中樞神經(jīng)興奮傳導(dǎo)和過度放電，當(dāng)其表達(dá)下降時(shí)，促覺醒核團(tuán)功能增強(qiáng)，誘發(fā)覺醒[44]。酸棗仁總皂苷能夠顯著上調(diào)海馬組織中GABA水平，從而發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的作用。NO能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性的發(fā)育，與學(xué)習(xí)記憶的形成過程有著緊密的聯(lián)系[45-46]。本研究表明酸棗仁總皂苷可顯著回調(diào)海馬組織中5-HT、GABA與NO水平，從而發(fā)揮直接改善學(xué)習(xí)記憶損傷的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的酸棗仁總皂苷均能顯著減少大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的總路程，延長(zhǎng)靜止時(shí)間，增加水迷宮指標(biāo)中目標(biāo)象限停留時(shí)間、平均速度及進(jìn)入次數(shù)，提高海馬組織中5-HT、GABA、NO的水平，但低劑量組效果稍優(yōu)于高劑量組，為非線性量-效關(guān)系。中藥的內(nèi)在成分極其復(fù)雜，不符合中藥劑量-效應(yīng)關(guān)系，可能是中藥各種成分之間產(chǎn)生拮抗作用的結(jié)果，從而降低其藥理活性[47]。此外，中藥通常還具有雙向調(diào)節(jié)的作用，低劑量具有促進(jìn)效應(yīng)，高劑量具有抑制效應(yīng)。研究表明，GABAA受體參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶[48]，酸棗仁皂苷B能激活GABAA受體的表達(dá)[49]，從而改善學(xué)習(xí)記憶，但高劑量的酸棗仁皂苷B會(huì)使GABAA過表達(dá)，造成學(xué)習(xí)記憶損傷[50]。因此，酸棗仁總皂苷改善學(xué)習(xí)記憶損傷未呈現(xiàn)量效關(guān)系可能是上述原因造成的。

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑是酸棗仁總皂苷調(diào)控海馬組織中最為主要的一條代謝途徑。苯丙氨酸和酪氨酸與體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平息息相關(guān)，苯丙氨酸可以經(jīng)過苯丙氨酸羥化酶的作用合成酪氨酸[51]，進(jìn)而產(chǎn)生多巴胺、去甲腎上腺素以及腎上腺素，這些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)均密切參與睡眠-覺醒過程，是引起失眠的重要神經(jīng)遞質(zhì)[52-53]。色氨酸是參與控制神經(jīng)中樞的重要代謝物，可由TPH催化合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT[54]。本研究結(jié)果顯示，酸棗仁總皂苷可能通過苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑，調(diào)控苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸及代謝途徑的中間產(chǎn)物多巴胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)水平改善失眠，進(jìn)而改善模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶損傷。

精氨酸與脯氨酸代謝途徑是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的重要途徑[55]。精氨酸是NO的直接前體，可促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)元型一氧化氮合酶、c-Fos的表達(dá)及新生神經(jīng)元的生成，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力。NO作為重要的信號(hào)分子，介導(dǎo)、參與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的特定生理過程[56-57]。脯氨酸是組成酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）的重要氨基酸。Pyk2通過激活蛋白酪氨酸激酶通路，增強(qiáng)-甲基--天冬氨酸受體活性，使蛋白質(zhì)磷酸化增強(qiáng)，促使鈣離子大量流入突觸后神經(jīng)元，因而產(chǎn)生較強(qiáng)的興奮性突觸后電位，影響海馬突觸可塑性，進(jìn)而改善記憶損傷[58]。本研究中酸棗仁總皂苷能夠顯著回調(diào)海馬組織中NO水平，上調(diào)精氨酸和脯氨酸的水平，進(jìn)而改善失眠引起的記憶損傷。組氨酸代謝途徑是維持腦內(nèi)組胺穩(wěn)態(tài)的重要途徑[59]。組氨酸是組胺的前體，組胺是促進(jìn)覺醒和維持覺醒狀態(tài)的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，下丘腦后部的結(jié)節(jié)乳頭體核內(nèi)組胺能神經(jīng)元具有促進(jìn)和維持覺醒的作用[60]。組胺也可以通過增強(qiáng)基底核的膽堿能神經(jīng)的活性，增加海馬內(nèi)膽堿含量而改善認(rèn)知能力[61]。本研究表明酸棗仁總皂苷可以顯著上調(diào)海馬組織中組氨酸水平，從而改善學(xué)習(xí)記憶損傷。

綜上所述，本研究采用PCPA復(fù)制失眠大鼠模型，整合藥效學(xué)和代謝組學(xué)的方法，從整體水平上探討了酸棗仁總皂苷改善失眠導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷的作用機(jī)制。酸棗仁總皂苷能夠顯著回調(diào)水迷宮行為學(xué)指標(biāo)，改善失眠引起的大鼠記憶損傷，并使海馬胞質(zhì)空泡化損傷恢復(fù)，顯著上調(diào)海馬組織中5-HT、GABA、NO水平，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶損傷。此外，酸棗仁總皂苷能夠恢復(fù)PCPA引起的海馬中氨基酸代謝紊亂和代謝輪廓異常，進(jìn)而發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶損傷的作用。本研究在代謝層面發(fā)現(xiàn)調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的氨基酸通路，并提供了代謝物類別和相對(duì)含量層面的信息。失眠模型動(dòng)物海馬代謝譜的改變對(duì)研究失眠模型下的學(xué)習(xí)記憶損傷過程具有重要價(jià)值，但其代表的生物學(xué)意義仍需要謹(jǐn)慎解釋和驗(yàn)證，需進(jìn)一步在細(xì)胞、蛋白等分子水平上深入研究。本研究將為進(jìn)一步深入探討酸棗仁總皂苷改善PCPA失眠大鼠學(xué)習(xí)記憶提供研究基礎(chǔ)，為酸棗仁總皂苷的新藥創(chuàng)制研究提供科學(xué)參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of total saponins ofon learning and memory impairment in-4-chlorophenylalanine-induced insomnia rats

HENG Yi-ran1, DUAN Hui-zhu1, DU He1, YAN Yan2, DU Chen-hui1

1. School of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China 2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

To study the effect of total saponins of Suanzaoren (, SZSS) on endogenous metabolites in insomnia model rats based on metabolomics, and explore the effect and mechanism of SZSS on learning and memory.-4-chlorophenylalanine (PCPA) was used to induce insomnia model in rats, diazepam and SZSS were given for intervention. Open field experiment and Morris water maze experiment were carried out; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of hippocampus; Levels of 5- hydroxytryptamine (5-HT), γ-aminobutyric acid (GABA) and NO (nitric oxide) in hippocampus were measured by ELISA. UPLC-Orbitrap-MS/MS was used to analyze the metabolic profile of hippocampus, combined with multivariate statistical analysis to screen out the different metabolites, and based on MetaboAnalyst 5.0 database, metabolic pathway and metabolic network were analyzed, metabolic characteristics and action ways of SZSS to improve learning and memory were discussed from various angles.Compared with model group, learning ability of rats in SZSS group was significantly improved (< 0.05, 0.01), pathological structure of hippocampus was significantly improved, levels of 5-HT, GABA and NO in hippocampus were significantly increased (< 0.05, 0.01). A total of 18 potential biomarkers related to learning and memory impairment had been identified by metabonomics. SZSS mainly played a role in improving memory impairment through seven major amino acid metabolic pathways such as phenylalanine, tyrosine and tryptophan.SZSS can improve the learning and memory loss caused by insomnia by regulating endogenous differential metabolites in hippocampus and regulating related amino acid metabolic pathways.

total saponins of; insomnia; learning and memory; hippocampus; differential metabolites

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6759 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.013

2022-07-15

山西省科技廳中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（YDZJSX2021C025）；山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123237，20210302123470）；山西省衛(wèi)生健康委“十大晉藥”項(xiàng)目（ZYCZL2020007）；山西中醫(yī)藥大學(xué)青年科學(xué)家培育項(xiàng)目（2021PY-QN-07）

衡依然（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮庐a(chǎn)品開發(fā)與利用。Tel: 18622138832 E-mail: hengyiran1@163.com

閆 艷，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制及中藥體內(nèi)過程分析。Tel: (0351)7018379 E-mail: yanyan520@sxu.edu.cn

杜晨暉，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (0351)179982 E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]