武宇佳，萬浩芳，李 暢，萬海同，楊潔紅

·藥劑與工藝·

基于HPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與HPLC的通脈降糖膠囊成分分析及指紋圖譜研究

武宇佳，萬浩芳，李 暢，萬海同，楊潔紅*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

開發(fā)一種基于HPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的通脈降糖膠囊（Tongmai Jiangtang Capsule，TJC）全局定性分析的檢測方法，同時應(yīng)用液相色譜建立TJC的HPLC指紋圖譜，并對其主要成分進行定量分析，為TJC的全面質(zhì)量評價及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。利用Thermo Fisher Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)對TJC化學(xué)信息進行采集，結(jié)合數(shù)據(jù)庫、文獻檢索及對照品比對等手段進行TJC成分鑒定。采用Capcell Pak C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），以0.5%甲酸水溶液-0.5%甲酸乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，柱溫40 ℃，體積流量0.4 mL/min，對15批次TJC樣品進行檢測，同時建立指紋圖譜，應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）進行相似度評價和共有峰指認(rèn)，并對其中8個指標(biāo)成分進行定量測定。利用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)共鑒定出TJC中150種化合物。15批TJC的指紋圖譜相似度均在0.97以上，共標(biāo)定25個共有峰，指認(rèn)其中8個色譜峰（原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B以及丹參酮IIA），對其進行HPLC定量分析，結(jié)果顯示所有目標(biāo)成分均線性良好（2＞0.999），平均回收率均在95.30%～103.56%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為原兒茶酸0.204～0.482 mg/g、原兒茶醛0.345～0.516 mg/g、葛根素5.374～8.805 mg/g、3′-甲氧基葛根素1.148～2.075 mg/g、葛根素芹菜糖苷1.327～2.204 mg/g、大豆苷1.378～2.276 mg/g、丹酚酸B 3.065～4.918 mg/g以及丹參酮IIA0.412～0.594 mg/g。所建立的成分鑒定、指紋圖譜和定量分析方法穩(wěn)定可行、結(jié)果可靠，適用于TJC的綜合質(zhì)量評價，可為TJC產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考借鑒。

通脈降糖膠囊；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量控制；Q-Exactive；原兒茶酸；原兒茶醛；葛根素；3′-甲氧基葛根素；葛根素芹菜糖苷；大豆苷；丹酚酸B；丹參酮IIA

通脈降糖膠囊（Tongmai Jiangtang Capsule，TJC）收載于國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［WS-11213（ZD-1213）-2002-2012Z］[1]，國藥準(zhǔn)字Z20026853。其以玄參、黃芪為君藥，黃連、太子參、水蛭、蒼術(shù)、葛根為臣藥，丹參、山藥、絞股藍為佐藥，冬葵果為使藥，具有養(yǎng)陰清熱、活血通絡(luò)之功效，用于氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻所致的消渴病（糖尿?。2]。方中君藥玄參清熱涼血、滋陰降火，具有抗炎、保肝、抗氧化、抗血小板聚集等作用[3-4]；黃芪性溫、味甘，可補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒升肌、利水退腫，具有保護心血管、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[5-6]。臣藥黃連清熱燥濕、瀉火解毒，具有降血糖、抗菌、抗炎、抗腫瘤、調(diào)血脂等作用[7]；蒼術(shù)祛風(fēng)散寒、健脾化濕，有抗炎癥腫瘤、降血糖、抑菌[8]的功效；太子參可生津潤肺、益氣健脾，主要有心肌保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、抗應(yīng)激、抗疲勞、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳等藥理作用[9]；葛根生津止渴、升陽止瀉，具有解熱、抗炎、抗感染、降血壓、降血糖、調(diào)血脂、改善生殖功能等功效[10]；水蛭為動物類中藥，咸、苦，性平，歸肝經(jīng)，可破血通經(jīng)、逐瘀消癥，具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、抗炎癥、保護腦及細胞等功效[11]。全方共奏燥濕化痰、活血通絡(luò)、益氣降糖之功。

已有研究表明，TJC在改善糖尿病性周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)功能、神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)方面，具有明顯的優(yōu)勢，是防止糖尿病神經(jīng)病變的有效藥物[12]。例如，將TJC聯(lián)合化學(xué)藥應(yīng)用于治療2型糖尿病且處在腦梗死恢復(fù)期的患者，可改善患者糖脂代謝，下調(diào)炎性因子表達水平，改善患者神經(jīng)功能及短期預(yù)后效果[13]。張愛旗等[14]觀察了106例氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻所致的糖尿病周圍神經(jīng)病變患者，發(fā)現(xiàn)TJC能改善血液流變學(xué)、神經(jīng)缺血缺氧，同時提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善肢體麻木疼痛、感覺減退等癥狀。徐靜等[15]觀察100例病例，發(fā)現(xiàn)TJC能通過調(diào)節(jié)患者的血脂水平，減少高脂血癥對血管內(nèi)皮的損壞，在保護血管的同時進一步改善周圍血液循環(huán)，起到對糖尿病神經(jīng)病變的防治作用。張斌等[16]利用糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TJC可作用于微循環(huán)系統(tǒng)及神經(jīng)細胞，并可能通過抑制白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的表達抑制雪旺細胞凋亡。但是目前關(guān)于TJC的研究大多集中于藥理及臨床療效方面，對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)研究較少，僅對方中黃連、黃芪以及太子參的部分成分進行評價，未見針對TJC全方的化學(xué)輪廓定性分析及指標(biāo)成分的定量研究。且現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅對TJC中的鹽酸小檗堿（來源于黃連）進行評價（不少于1.25 mg/g）[1]，尚缺乏其他主要成分的質(zhì)控依據(jù)。鑒于此，本實驗采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫篩查、文獻檢索、對照品比對等方式，對TJC全方進行化學(xué)成分的定性表征，同時建立TJC指紋圖譜及HPLC多成分含量測定方法，為TJC的全面質(zhì)量評價和控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀，美國Agilent科技有限公司；Thermo Fisher Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀，連接Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Heraeus Fresco 21離心機，美國Thermo Fisher公司；DLAB MX-F型固定式混勻儀，北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠。

1.2 藥品與試劑

TJC，批號200803、200502、201002、210302、190301、210902、210502、210603、210401、210501、220502、220103、220701、220601、220702，分別編號為S1～S15，由保定天浩制藥有限公司提供。對照品：原兒茶醛，批號L17A9D59027，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司；原兒茶酸（批號A2108151，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）、丹參酮IIA（批號D1720010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上海阿拉丁生物科技有限公司；葛根素，批號RH135778，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；3′-甲氧基葛根素（批號AF20073104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批號AF20073106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、大豆苷（批號AF9091822，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、丹酚酸B（批號AF20092021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），成都埃法生物科技有限公司。甲酸，體積分?jǐn)?shù)88%，購自上海阿拉丁生物科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購自美國天地試劑公司；實驗用水取自Milli-Q純水機，Millipore公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA對照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.10、0.10、1.00、0.40、0.24、0.40、1.00、0.10 mg/mL的混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液依次稀釋成質(zhì)量濃度為原兒茶酸0.100、0.090、0.080、0.070、0.060、0.050、0.040、0.030、0.020、0.010 mg/mL，原兒茶醛0.100、0.090、0.080、0.070、0.060、0.050、0.040、0.030、0.020、0.010 mg/mL，葛根素1.000、0.900、0.800、0.700、0.600、0.500、0.400、0.300、0.200、0.100 mg/mL，葛根素芹菜糖苷0.400、0.360、0.320、0.280、0.240、0.200、0.160、0.120、0.080、0.040 mg/mL，3′-甲氧基葛根素0.240、0.135、0.120、0.105、0.090、0.075、0.060、0.045、0.030、0.015 mg/mL，大豆苷0.400、0.360、0.280、0.240、0.200、0.160、0.120、0.080、0.040、0.015 mg/mL，丹酚酸B1.000、0.900、0.800、0.700、0.600、0.500、0.400、0.300、0.200、0.100 mg/mL，丹參酮IIA0.100、0.090、0.080、0.070、0.060、0.050、0.040、0.030、0.020、0.010 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取TJC內(nèi)容物適量，混勻，精密稱取100.0 mg，加入70%甲醇1 mL，密塞，稱定質(zhì)量。50 ℃超聲提取2次，每次30 min，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，在4 ℃下以13 800×離心10 min，離心3次，合并上清液，稀釋至原來的70%，即得供試品溶液。

2.2 利用HPLC-Q-Exactive-MS對TJC成分進行定性分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相A為0.5%甲酸水溶液，B為0.5%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫：0～18 min，5%～18% B；18～23 min，18%～20% B；23～25 min，20%～30% B；25～40 min，30% B；40～42 min，30%～95% B；42～52 min，95% B；52～53 min，95%～5% B；53～58 min，5% B；檢測波長203、260、280、310 nm；柱溫40 ℃；體積流量0.4 mL/min；進樣量5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 使用Thermo Fisher Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀，離子源為HESI源。負離子檢測模式：輔助氣體積流量30 L/min，噴霧電壓2.8 kV，離子傳輸管溫度400 ℃，輔助氣溫度100 ℃，碰撞能量（CE）為30 eV。檢測方式為Full MS/dd-MS2，分辨率分別為70 000和17 500，掃描范圍/110～1500。數(shù)據(jù)采集使用Thermo Xcalibur軟件實現(xiàn)。

2.2.3 TJC化學(xué)成分的定性分析 按照“2.1.2”項下方法制備TJC供試品溶液，以“2.2.1”和“2.2.2”項下的條件對TJC的化學(xué)信息譜進行采集。根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子及二級碎片信息，通過對照品比對、參考文獻建立數(shù)據(jù)庫并以Compound Discoverer軟件進行檢索比對等方式，對各色譜峰進行推測與鑒定。推測出TJC中150種化合物。TJC的基峰離子流圖（base peak chromatogram，BPC）見圖1，各成分質(zhì)譜信息見表1。

根據(jù)鑒定結(jié)果，TJC中化合物類別主要包括有機酸類、黃酮類、糖苷類、環(huán)烯醚萜類等。其中有機酸類包括奎寧酸、檸檬酸、香草酸、沒食子酸、原兒茶酸、4--阿魏?？崴?、咖啡酸、迷迭香酸、壬二酸、阿魏酸、丹酚酸A、丹酚酸B等。黃酮類化合物包含3′-甲氧基葛根素、葛根素、3′-羥基葛根素、大豆苷、芹菜甙、芒柄花苷芒柄花素等。環(huán)烯醚萜類化合物有哈巴苷、哈巴俄苷等。

2.3 TJC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度考察 將批號分別為190301、200502和210502的藥品等質(zhì)量混勻，用于方法學(xué)驗證。

圖1 TJC的BPC

表1 TJC中各成分的質(zhì)譜信息

Table 1 Mass spectrometry information of components in TJC

峰號tR/min成分化學(xué)式母離子相對分子質(zhì)量(m/z)主要碎片 (m/z) 理論值實測值偏差(×10?6) 13.37L-刀豆氨酸C5H12N4O3[M－H]?175.083 1 175.083 0 ?0.57173.103 8, 146.960 4, 131.081 7 23.38L-組氨酸C6H9N3O2[M－H]?154.061 7 154.061 5 ?1.30154.061 5, 137.034 9, 93.044 6 33.39L-精氨酸C6H14N4O2[M－H]?173.103 9 173.103 8 ?0.58156.077 1, 146.960 4, 131.081 7 43.82麥芽糖C12H22O11[M－H]?341.108 4 341.109 0 1.76221.066 0, 179.055 7, 119.034 0, 89.023 3 53.83D-葡萄糖醛酸C6H10O7[M－H]?193.034 8 193.034 8 0.00191.055 7, 111.007 7, 103.002 6, 85.028 3 63.97奎寧酸C7H12O6[M－H]?191.055 6 191.055 5 ?0.52111.007 7, 103.002 6, 85.028 3 74.26枸杞酸C12H18O11[M－H]?337.077 1 337.078 0 2.67277.056 7, 216.909 7, 174.016 3, 157.013 4 85.55檸檬酸C6H8O7[M－H]?191.019 2 191.019 1 ?0.52173.008 9, 129.018 4, 111.077 6, 87.007 6 95.56尿苷C9H12N2O6[M－H]?243.061 7 243.062 2 2.06200.056 2, 152.034 6, 140.034 5, 110.023 7 105.772-哌啶甲酸C6H11NO2[M－H]?128.071 2 128.071 7 3.9082.028 6 115.97鳥苷C10H13N5O5[M－H]?282.083 8 282.084 9 3.90150.041 4, 133.014 6 126.27L-酪氨酸C9H11NO3[M－H]?180.066 1 180.066 2 0.56163.039 4, 152.916 9, 136.871 4, 119.049 2 136.29肌苷C10H12N4O5[M－H]?267.072 9 267.074 0 4.12230.940 8, 135.030 4, 129.018 4 146.40腺苷C10H13N5O4[M－H]?266.088 9 266.090 1 4.51150.041 4, 135.030 3, 129.018 3 156.75富馬酸C4H4O4[2M－H]?231.014 1 231.014 7 2.60214.965 6, 188.926 8, 115.002 6, 96.958 9 167.58熊果苷C12H16O7[M－H]?271.081 8 271.082 9 4.06151.039 3, 123.044 3 178.01山梔苷C16H24O11[M－H]?391.124 0 391.125 5 3.84346.051 6, 237.206 0, 191.946 1, 183.066 0 188.10沒食子酸C7H6O5[M－H]?169.013 7 169.013 6 ?0.59126.026 9, 125.023 5 199.813,4-二氫甲基梓醇C16H26O10[M－H]?377.144 8 377.145 6 2.12310.870 9, 219.027 3, 174.955 5, 96.959 0 209.84丁香酸葡萄糖苷C15H20O10[M－H]?359.097 8 359.098 8 2.78197.045 2, 179.034 5, 72.991 9 219.99梓醇C15H22O10[M－H]?361.113 5 361.114 7 3.32/ 2210.73車葉草苷酸C18H24O12[M－H]?431.119 0 431.119 3 0.70385.098 1, 174.955 7, 137.023 6 2310.74哈巴苷C15H24O10[M＋FA－H]?409.134 6 409.135 6 2.44294.030 2, 201.076 6, 183.065 9, 89.023 3 2411.16泛酸C9H17NO5[M－H]?218.102 8 218.103 3 2.29190.986 9, 146.081 5, 88.039 2 2511.29香草酸C8H8O4[M－H]?167.034 4 167.034 4 0.00149.023 6, 139.039 2, 123.044 3 2611.31丹參素C9H10O5[M－H]?197.045 0 197.045 1 0.51179.034 5, 135.044 3, 123.044 2, 72.991 9

續(xù)表1

續(xù)表1

峰號tR/min成分化學(xué)式母離子相對分子質(zhì)量(m/z)主要碎片 (m/z) 理論值實測值偏差(×10?6) 6830.37毛蕊花糖苷C29H36O15[M－H]?623.197 6623.199 22.57 579.150 2, 461.168 0, 161.023 8 6930.65(S)-柚皮素C15H12O5[M－H]?271.060 6271.061 84.43 241.050 7, 201.022 6, 186.929 5 7030.66松脂醇葡萄糖苷C26H32O11[M－H]?519.186 6519.188 43.47 445.231 8, 357.134 9, 248.900 8, 151.039 4 7130.86柚皮苷C27H32O14[M－H]?579.171 4579.172 92.59 417.156 1, 402.132 7, 291.064 2, 181.050 1 7230.88異綠原酸AC25H24O12[M－H]?515.119 0515.120 32.52 253.050 6, 191.055 7, 174.955 6, 171.055 7 7331.14安格洛苷CC36H48O19[M－H]?783.271 2783.273 12.43 764.644 8, 461.167 8, 193.050 4, 175.039 6 7431.36ningposide AC18H22O9[M－H]?381.118 6381.119 83.15 362.933 6, 193.050 3, 174.955 4, 149.060 1, 134.036 5 7531.49柚皮素-7-O-葡萄糖苷C21H22O10[M－H]?433.113 5433.114 62.54 389.085 8, 311.056 2, 269.041 1, 178.998 2 7631.59肉蓯蓉苷CC30H38O15[M－H]?637.213 2637.215 12.98 553.469 8, 304.914 8, 223.061 3, 161.023 8 7731.63丹酚酸EC36H30O16[M－H]?717.145 6717.147 83.07 339.051 5, 321.041 1, 295.061 8, 185.024 0 7832.03桂葉苷C29H36O13[M－H]?591.207 8591.209 73.21 473.125 4, 304.914 6, 174.955 6 7932.03scrophuloside A2C32H40O17[M－H]?695.218 7695.220 62.73 678.358 9, 599.312 1, 419.135 7, 145.028 8 8032.15ningposide CC17H20O8[M－H]?351.108 0351.109 33.70 328.062 2, 163.040 0, 145.028 8, 119.049 3 8132.23迷迭香酸C18H16O8[M－H]?359.076 7359.077 83.06 197.045 3, 179.034 6, 161.023 8, 135.044 4 8232.39丹酚酸AC26H22O10[M－H]?493.113 5493.114 82.64 295.061 7, 197.045 1, 185.024 0, 109.028 5 8332.39丹酚酸IC27H22O12[M－H]?537.103 3537.104 72.61 295.061 7, 185.024 0, 109.028 5, 61.987 2 8432.48壬二酸C9H16O4[M－H]?187.097 0187.097 00.00 169.086 5, 125.096 3, 97.064 8 8533.00二氫阿魏酸C10H12O4[M－H]?195.065 7195.066 54.10 182.022 0, 152.896 4, 128.034 6, 122.036 4 8633.46鄰苯二甲酸C8H6O4[M－H]?165.018 8165.018 7?0.61 136.931 4, 121.028 6, 96.959 0 8733.55丹參酚酸BC36H30O16[M－H]?717.145 6717.146 91.81 339.051 5, 321.041 1, 295.061 6, 185.024 0 8833.60羥甲香豆素C10H8O3[M－H]?175.039 5175.039 1?2.29 160.016 1, 146.960 5, 118.965 3 8934.03阿魏酸C10H10O4[M－H]?193.050 1193.050 20.52 163.950 7, 134.036 6, 111.007 8, 61.987 2 9034.08黃芩苷C21H18O11[M－H]?445.077 1445.078 42.92 310.871 1, 269.046 2, 174.955 7 9134.08芒柄花苷C22H22O9[M＋FA－H]?475.124 0475.125 02.10 267.066 8 9236.25白楊素C15H10O4[M－H]?253.050 1253.050 82.77 209.059 6, 149.144 5 9337.40甘草素C15H12O4[M－H]?255.065 7255.066 63.53 186.929 0, 153.018 6, 135.007 9, 119.049 2 9437.797,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基-C23H28O10[M－H]?463.160 4463.161 93.24 301.108 6, 287.088 8, 135.044 4, 121.028 5 異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷 9538.40哈巴俄苷C24H30O11[M－H]?493.171 0493.172 32.64 165.055 2, 147.044 4, 89.023 3 9638.97槲皮素C15H10O7[M－H]?301.034 8301.035 83.32 273.040 8, 178.998 1, 151.002 9, 121.028 5 9739.25金合歡素C16H12O5[M－H]?283.060 6283.061 53.18 268.038 2 9841.54龍膽根素C14H10O5[M－H]?257.045 0257.045 72.72 221.842 2, 186.928 9, 163.003 1, 135.007 9 9942.70熊竹素C17H14O6[M－H]?313.071 2313.072 12.87 298.048 8, 283.025 6, 174.955 6, 146.960 2 10045.42黃芪皂苷VIC47H78O19[M－H]?945.505 9945.507 01.16 / 10145.49hareftoside EC47H76O18[M－H]?927.495 3927.498 33.23 777.428 3, 764.584 7, 678.328 6, 442.217 1 10245.49人參皂苷Rb1C54H92O23[M－H]?1 107.595 11 107.597 52.17 961.537 1, 799.488 8, 637.434 1, 475.379 6 10345.62地黃苷C31H40O15[M－H]?651.228 9651.231 43.84 562.208 1, 485.901 8, 329.235 4, 209.118 8 10445.637-O-methylisomucronulatolC18H20O5[M－H]?315.123 2315.124 43.81 297.114 1, 285.114 5, 211.134 5, 180.912 2, 112.984 7 10545.68芹菜素C15H10O5[M－H]?269.045 0269.046 24.46 225.149 5, 165.978 6, 151.003 0, 119.049 2 10645.69wistariasaponin B2C48H78O19[M－H]?957.505 9957.507 71.88 911.500 9, 764.678 4, 749.446 4, 667.407 3, 497.122 7 10745.80異丁香酚甲醚C11H14O2[M－H]?177.091 6177.091 5?0.56 150.030 3, 135.044 5, 123.018 8 10845.83垂崖豆藤異黃烷醌C17H16O6[M－H]?315.086 9315.087 82.86 285.082 7, 161.023 7, 109.028 5

續(xù)表1

取混合TJC粉末制備的供試品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，以11號峰為參照峰（該色譜峰分離度較好，且有較大的峰面積），計算25個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.59%，相對峰面積的RSD均小于3.34%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 中間精密度考察 將批號為210501、210502和220502的藥品等質(zhì)量混勻，按照“2.1.2”項下方法，在不同時期，由2名實驗人員分別平行制備6份供試品溶液，各自制備TJC供試品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件進樣，以11號峰為參照峰計算25個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.46%，相對峰面積的RSD均小于4.89%，表明該方法中間精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性考察 取“2.3.1”項所述混合TJC粉末，按照“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液。按照“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以11號峰為參照峰，計算25個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.16%，相對峰面積的RSD均小于4.70%，表明該檢測方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取“2.3.1”項所述混合TJC粉末，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，制備后樣品置于4 ℃冰箱。分別于制備后0、2、4、6、10、12 h，按照“2.2.1”項色譜條件進樣測定，以11號峰為參照峰，計算25個共有峰的相對保留時間以及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.74%，相對峰面積的RSD均小于4.62%，表明12 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.3.5 HPLC指紋圖譜的采集 取15個不同批次的TJC，依照“2.1.2”項下方法分別制備15批TJC供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版本）》對所得15批樣品的色譜圖進行分析，以其中的S1圖譜作為參照譜，采用多點校正后進行自動匹配（時間窗為0.1 min），用中位數(shù)法生成指紋圖譜以及對照圖譜（圖2）。

2.3.6 共有峰的指認(rèn) 根據(jù)指紋圖譜結(jié)果，共標(biāo)定25個色譜峰。通過與混合對照品（圖3）進行比對，分別指認(rèn)了8個色譜峰，其中6號峰為原兒茶酸、9號峰為原兒茶醛、11號峰為葛根素、12號峰為葛根素芹菜糖苷、13號峰為3′-甲氧基葛根素、15號峰為大豆苷、18號峰為丹酚酸B、25號峰為丹參酮IIA。由于11號峰面積最大、分離度良好、出峰時間適中，故選擇此峰為參照峰。

2.3.7 相似度評價 用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版本）》對所得15批TJC樣品的指紋圖譜以及其對照圖譜進行相似度計算，結(jié)果見表2。15批次樣品（S1～S15）的指紋圖譜與對照圖譜的相似度分別為0.981、0.985、0.987、0.992、0.991、0.990、0.992、0.989、0.988、0.984、0.973、0.982、0.990、0.987、0.979。結(jié)果顯示，15批TJC與對照譜圖的相似度均在0.97以上，這表明15批次TJC之間的差異較小，其質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性良好。

圖2 15批TJC的指紋圖譜 (S1～S15) 和對照圖譜(R)

6-原兒茶酸 9-原兒茶醛 11-葛根素 12-葛根素芹菜糖苷 13-3′-甲氧基葛根素 15-大豆苷 18-丹酚酸B 25-丹參酮IIA

2.4 HPLC測定TJC中8種指標(biāo)成分的含量

2.4.1 線性關(guān)系考察 將一系列混合對照品溶液按照“2.2.1”項下的色譜條件依次進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），得到各成分的回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果可知，在較寬的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所有校準(zhǔn)曲線均表現(xiàn)出良好的線性（2＞0.999），檢測限和定量限分別在0.287～1.001 μg/mL和0.869～3.034 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗 取“2.3.1”項所述混合TJC粉末制備的供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，得8種指標(biāo)成分原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA的保留時間以及含量，計算其RSD分別為0.46%、0.61%、0.39%、0.33%、0.32%、0.25%、0.07%、0.02%和1.09%、0.24%、0.31%、0.43%、1.48%、0.85%、0.36%、0.70%。由結(jié)果可知，8種化合物保留時間的RSD均小于0.61%，含量的RSD均小于1.48%，表明該方法進樣精密度良好。

2.4.3 中間精密度考察 取“2.3.2”項所述混合TJC粉末，按照“2.1.2”項下方法，在不同時期，由2名實驗人員分別平行制備6份供試品溶液，各自制備TJC供試品溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件進樣，得8種指標(biāo)成分原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA的保留時間及含量，計算其RSD值分別為0.44%、0.48%、0.50%、0.63%、0.55%、0.72%、0.86%、0.35%和1.90%、3.99%、3.43%、2.37%、3.93%、2.95%、2.86%、1.28%。由結(jié)果可知，8種指標(biāo)成分保留時間的RSD均小于0.86%，含量的RSD均小于3.99%，表明該方法中間精密度良好。

表2 15批次TJC相似度評價結(jié)果

Table 2 Similarities of 15 batches of TJC

樣品相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15對照 S11.0000.9770.9690.9640.9600.9770.9790.9740.9640.9740.9490.9630.9620.9540.9590.981 S20.9771.0000.9610.9720.9700.9680.9700.9650.9720.9580.9690.9760.9690.9600.9730.985 S30.9690.9611.0000.9900.9900.9770.9870.9900.9850.9900.9330.9530.9720.9640.9560.987 S40.9640.9720.9901.0000.9900.9870.9860.9850.9860.9780.9560.9650.9760.9790.9630.992 S50.9600.9700.9900.9901.0000.9780.9810.9830.9860.9770.9540.9660.9840.9770.9670.991 S60.9770.9680.9770.9870.9781.0000.9840.9780.9740.9720.9660.9720.9770.9830.9580.990 S70.9790.9700.9870.9860.9810.9841.0000.9950.9870.9910.9490.9610.9780.9710.9610.992 S80.9740.9650.9900.9850.9830.9780.9951.0000.9870.9920.9370.9540.9770.9630.9610.989 S90.9640.9720.9850.9860.9860.9740.9870.9871.0000.9820.9440.9530.9750.9630.9610.988 S100.9740.9580.9900.9780.9770.9720.9910.9920.9821.0000.9260.9470.9700.9560.9530.984 S110.9490.9690.9330.9560.9540.9660.9490.9370.9440.9261.0000.9870.9650.9800.9570.973 S120.9630.9760.9530.9650.9660.9720.9610.9540.9530.9470.9871.0000.9710.9760.9630.982 S130.9620.9690.9720.9760.9840.9770.9780.9770.9750.9700.9650.9711.0000.9840.9790.990 S140.9540.9600.9640.9790.9770.9830.9710.9630.9630.9560.9800.9760.9841.0000.9650.987 S150.9590.9730.9560.9630.9670.9580.9610.9610.9610.9530.9570.9630.9790.9651.0000.979 對照0.9810.9850.9870.9920.9910.9900.9920.9890.9880.9840.9730.9820.9900.9870.9791.000

表3 HPLC測定TJC主要成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線和范圍

Table 3 Standard curves and ranges of main ingredients in TJC by HPLC determination

成分回歸方程R2線性范圍/(mg·mL?1)檢測限/(μg·mL?1)定量限/(μg·mL?1) 原兒茶酸Y＝19 147 X－1.462 30.999 00.010～0.0800.8922.704 原兒茶醛Y＝60 924 X－125.30.999 00.020～0.0800.6301.909 葛根素Y＝21 375 X－99.5860.999 30.100～0.9000.2870.869 葛根素芹菜糖苷Y＝15 083 X－58.8780.999 10.040～0.4001.0013.034 3′-甲氧基葛根素Y＝21 374 X－26.1050.999 60.030～0.2400.9102.757 大豆苷Y＝23 127 X－124.840.999 50.015～0.2400.4401.333 丹酚酸BY＝15 166 X－25.8890.999 10.100～0.8000.3290.996 丹參酮IIAY＝32 880 X－79.70.999 30.020～0.0800.5721.733

2.4.4 重復(fù)性考察 取“2.3.1”項所述混合TJC粉末適量，按照“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件依次進樣，得8種指標(biāo)成分原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA的保留時間以及含量，計算其RSD值分別為0.07%、0.05%、0.07%、0.05%、0.04%、0.04%、0.05%、0.01%和2.28%、2.47%、2.38%、4.50%、2.39%、2.31%、2.43%、1.57%。由結(jié)果可知，8種指標(biāo)成分保留時間的RSD均小于0.07%，含量的RSD均小于4.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 取“2.3.1”項所述混合TJC粉末，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，制備后樣品置于4 ℃冰箱。分別于制備后0、2、4、6、10、12 h，按照“2.2.1”項色譜條件進樣，得8種指標(biāo)成分原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA的保留時間及含量，計算其RSD值分別為0.66%、0.36%、0.33%、0.27%、0.24%、0.29%、0.16%、0.02%和4.46%、0.51%、0.17%、4.50%、1.97%、0.54%、0.60%、0.35%。結(jié)果顯示，8種指標(biāo)成分保留時間的RSD均小于0.66%，含量的RSD均小于4.50%，表明12 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率考察 取“2.3.1”項所述混合已知含量（原兒茶酸0.560 mg/g，原兒茶醛0.474 mg/g，葛根素7.210 mg/g，葛根素芹菜糖苷1.756 mg/g，3'-甲氧基葛根素1.860 mg/g，大豆苷1.778 mg/g，丹酚酸B 4.582 mg/g，丹參酮IIA0.496 mg/g）的TJC粉末，分別稱取9份，每份約0.05 g，隨機分成3組。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進行加樣回收試驗，每組樣品中分別加入用70%甲醇水溶液配制的相當(dāng)于原藥中8種指標(biāo)成分含量的80%、100%、120%的混合對照品溶液1 mL，密塞稱定質(zhì)量。50 ℃超聲提取2次，每次30 min，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，在4 ℃下以13 800×離心10 min，離心3次，合并上清液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄8種指標(biāo)成分的峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，最終質(zhì)量濃度均在線性范圍內(nèi)。結(jié)果原兒茶酸、原兒茶醛、葛根素、葛根素芹菜糖苷、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA的平均回收率分別為96.44%、98.39%、95.30%、102.15%、101.30%、103.56%、97.28%、96.19%，計算其RSD值分別為2.44%、4.12%、1.48%、4.15%、2.17%、3.92%、3.10%、4.43%。8種指標(biāo)成分的平均回收率均在95.30%～103.56%，且RSD均小于4.43%，該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.4.7 含量測定 按照“2.1.2”項下方法制備15批不同批次（S1～S15）的TJC供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，各批次重復(fù)進樣3次。記錄8種指標(biāo)成分的峰面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量，結(jié)果見表4。8種指標(biāo)成分中，葛根素、丹酚酸B等含量較高且穩(wěn)定，不同批次間含量差異較小。原兒茶酸的含量最低且不穩(wěn)定，不同批次間含量差異較大。

表4 15批次TJC中8種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果 (n = 3)

Table4 Content determination results of eight components of 15 batches of TJC(n = 3)

批號質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1) 原兒茶酸原兒茶醛葛根素3′-甲氧基葛根素葛根素芹菜糖苷大豆苷丹酚酸B丹參酮IIA 2008030.3710.4645.3741.3921.327 1.5314.7260.560 2005020.2550.4086.9041.4071.931 1.6593.1870.526 2010020.2040.4425.9021.6081.663 1.5423.5700.519 2103020.2240.4006.4511.2961.826 1.6533.0650.555 1903010.2330.4157.0371.6921.876 1.5773.5230.594 2109020.4820.3896.3681.5051.685 1.5464.1490.452 2105020.3250.4886.1541.5161.715 1.8924.1680.482 2106030.3670.3655.6321.1611.423 1.5913.2260.514 2104010.2670.3455.7201.1481.671 1.5403.5070.548 2105010.2220.3595.7281.4691.597 1.3783.9340.470 2205020.3810.4518.1191.5562.102 1.9783.9710.466 2201030.4530.4787.1982.0752.111 1.7323.3770.412 2207010.3220.4927.1481.4391.915 1.6033.4620.531 2206010.2930.4918.8051.6262.204 2.2764.9180.558 2207020.2890.5167.7451.5401.985 1.9173.2930.558 RSD/%27.0912.6314.9815.0113.9413.5814.949.69

3 討論

3.1 色譜條件的考察及提取方法的優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的優(yōu)選 考察了Capcell Pak C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Capcell Pak ADME（150 mm×4.6 mm，3 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）3種不同型號的色譜柱，結(jié)果顯示，經(jīng)Capcell Pak C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）色譜柱分離后，各色譜峰的分離效果最好，峰形尖銳，柱效最高，故選用Capcell Pak C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）色譜柱進行本實驗。

3.1.2 流動相條件的優(yōu)選 分別考察了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.5%甲酸水溶液-乙腈、0.5%甲酸水溶液-0.5%甲酸乙腈溶液、0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液等流動相體系。最終結(jié)果顯示，使用0.5%甲酸水溶液-0.5%甲酸乙腈溶液作為流動相時，洗脫效果最好，出峰情況良好，色譜峰的分離度較高，故選擇0.5%甲酸水溶液-0.5%甲酸乙腈溶液作為實驗最終的流動相。

3.1.3 柱溫的優(yōu)選 分別考察了30、35、40 ℃柱溫條件下色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示在40 ℃條件下峰形最好，基線平穩(wěn)，噪音較低，因此，選擇40 ℃為最終柱溫。

3.1.4 提取方法的優(yōu)化 對TJC提取工藝中的提取溶劑進行優(yōu)化。考察了純甲醇、50%甲醇、70%甲醇和純水作為提取溶劑時，對TJC中主要成分提取效率的影響。結(jié)果顯示，70%甲醇作為提取溶劑時提取率最高，且基線平穩(wěn)、出峰多、響應(yīng)值相對較高，故最終選用70%甲醇作為提取溶劑。

3.2 綜合分析

本研究利用HPLC-Q-Exactive MS對TJC進行全局定性分析，采用Full MS/dd-MS2檢測模式結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析篩查、對照品比對、人工解析等方法，鑒定出TJC中150種化合物，為后續(xù)TJC藥效研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時，本實驗建立了TJC的HPLC指紋圖譜，并對其中8種特征性指標(biāo)成分（原兒茶醛、原兒茶酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA）進行定量分析，結(jié)果顯示，葛根中的葛根素以及丹參中的丹酚酸B的含量相對較高且均高于現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所述小檗堿，可作為TJC中的質(zhì)量標(biāo)志物，為TJC的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

《本草綱目》中記載：“葛根，性甘、辛、平、無毒，主治：消渴、身大熱、嘔吐、諸弊，起陰氣，解諸毒”，葛根具有降血糖、延緩衰老、調(diào)節(jié)血脂、促進造血功能等方面的作用，并應(yīng)用于臨床。葛根提取物能有效降低I型糖尿病小鼠的空腹血糖值并減緩因糖尿病產(chǎn)生的體質(zhì)量下降情況[17-18]。葛根素可通過降血糖、調(diào)血脂、保護血管、抗氧化應(yīng)激、減輕炎性反應(yīng)和改善胰島素抵抗等機制來防治糖尿病, 并且可以改善微血管、大血管及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[19]。丹參-葛根藥對能有效降低II型糖尿病大鼠的空腹血糖、血脂水平及肝腎功能指標(biāo)，有效改善腎臟、胰臟病變[20]。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們推斷TJC治療糖尿病的藥效作用可能與其中的葛根素、丹酚酸B等化學(xué)成分有關(guān)。

通過上述研究，共鑒定TJC中150種化合物，主要包括有機酸類、黃酮類、糖苷類、環(huán)烯醚萜類以及糖類等；在TJC指紋圖譜中共標(biāo)定25個共有峰，比較15批次樣品，發(fā)現(xiàn)其相似度在0.97以上；建立的HPLC定量方法穩(wěn)定可靠，對8種主要成分（原兒茶醛、原兒茶酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、丹酚酸B、丹參酮IIA）進行了定量分析。

綜上，TJC主要含有機酸類、黃酮類等活性成分，其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。葛根素、丹酚酸B、3′-甲氧基葛根素等化合物含量較高且穩(wěn)定，可作為TJC的主要質(zhì)量標(biāo)志物。同時，本研究建立的中成藥成分定性、定量分析及指紋圖譜建立方法可為中藥復(fù)方研究和質(zhì)量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Composition analysis and fingerprint establishment of Tongmai Jiangtang Capsule based on HPLC-Q-Exactive-MS and HPLC

WU Yu-jia,WAN Hao-fang, LIChang,WANHai-tong, YANG Jie-hong

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To establish a set of analytical methods for global qualitative analysis, HPLC fingerprint, and main component quantification of Tongmai Jiangtang Capsule (通脈降糖膠囊, TJC) based on HPLC-Q-Exactive-MS, so as to provide scientific evidence for overall quality evaluation and control of TJC.In the present study, Thermo Fisher LC-Q-Exactive MS system was applied to collect MS information of the TJC components, which was further elucidated with the help of related databases, former publication and standard substances. HPLC analysis of TJC samples from 15 different batches was performed on a Capcell Pak C18column (150 mm × 4.6 mm, 3 μm) using 0.5% formic acid aqueous solution and 0.5% formic acid acetonitrile solution as mobile phases. The column temperature was 40 ℃, and the flow rate was 0.4 mL/min. Chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2012 edition) was applied for similarity evaluation, common peak identification, and simultaneous determination of eight index components was carried out.As the result, a total of 150 compounds in TJC were identified with high resolution HPLC-MS. The fingerprint similarities of TJC samples from 15 batches were all above 0.97, and 25 shared peaks were calibrated. Eight chromatographic peaks (representing protocatechuic acid, protocatechualdehyde, puerarin, 3′-methoxypuerarin, puerarin apigenoside, daidzein, salvianolic acid B, and tanshinone IIA) were identified and quantitatively analyzed with HPLC. The results showed that all target components had good linearity (2> 0.999), and the average recoveries were in the range of 95.30%—103.56%. The contents of protocatechuic acid, protocatechualdehyde, puerarin, 3′-methoxy puerarin, puerarin apigenoside, daidzein, salvianolic acid B and tanshinone IIAwere 0.204—0.482 mg/g, 0.345—0.516 mg/g, 5.374—8.805 mg/g, 1.148—2.075 mg/g, 1.327—2.204 mg/g, 1.378—2.276 mg/g, 3.065—4.918 mg/g and 0.412—0.594 mg/g, respectively.The integrated method for the qualitative, quantitative and fingerprint analysis of TJC established in this study was proven stable, feasible and reliable. It would be suitable for the comprehensive quality evaluation and control of TJC.

Tongmai Jiangtang Capsule; HPLC; fingerprint; quality control; Q-Exactive; protocatechuic acid; protocatechualdehyde; puerarin; 3′-methoxy puerarin; puerarin apigenoside; daidzein; salvianolic acid B; tanshinone IIA

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6686 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.005

2022-05-17

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1704200）；國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1704204）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2021ZQ025）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LR19H280001）

武宇佳，碩士研究生，主要從事中醫(yī)方劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: wuyujia1306859001@163.com

楊潔紅，博士，教授，主要從事中醫(yī)方劑學(xué)研究。E-mail: yjhong@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]