李玲紅 張 哲 陳永明 尤明山 倪中福 邢界文

普通小麥穎殼蠟質缺失突變體的轉錄組分析

李玲紅 張 哲 陳永明 尤明山 倪中福 邢界文*

中國農業(yè)大學農學院, 北京 100193

為了明確突變體穎殼蠟質含量顯著變化的分子機制, 本研究對源自濟麥22穎殼蠟質缺失突變體與野生型進行了轉錄組分析。結果表明, 在突變體中, 共篩選到12,230個差異表達基因, 其中5811個基因在突變體中上調表達, 6419個下調表達。GO (gene ontology)功能富集分析發(fā)現(xiàn), 差異基因主要富集在蠟質合成和轉運途徑, 具體分布在?；D移酶活性、脂質結合和水解酶活性等條目, 由此推測這些途徑與小麥穗部蠟質缺失性狀是緊密相關的。我們還利用RT-qPCR檢測了參與蠟質代謝途徑部分基因的表達, 結果與轉錄組結果是一致的。本研究為今后探究小麥蠟質代謝的分子機制和基因調控網絡提供了數(shù)據(jù)支持, 同時也為抗逆小麥育種奠定了理論基礎。

小麥; 表皮蠟質;突變體; 轉錄組分析; 分子機制

小麥是全球范圍內廣泛種植的重要糧食作物,總產量僅次于玉米。表皮蠟質(Epicuticular wax)是指覆蓋在植物地上部分表面的一層脂質有機混合物, 主要由烷烴類、醇類、醛類、酮類和脂肪酸等化合物組成[1]。表皮蠟質是植物與環(huán)境之間的保護屏障, 能夠保護植物免受干旱、紫外線、病原菌和昆蟲等的侵害[2]。因此, 研究表皮蠟質相關基因及調控機制對培育抗逆性作物品種, 提高糧食產量具有重要意義。

植物中蠟質化合物的合成發(fā)生在表皮細胞內, 主要分為3個階段。第一, 在質體(Plastid)中合成C16和C18脂肪酸: 以乙酰輔酶A為底物, 通過脂肪酸合酶(FAS)復合物對C2的連續(xù)縮合而伸長[3-4]; 第二, 在內質網(endoplasmic reticulum)中通過脂肪酸延伸酶復合物(FAE)進一步延伸為長鏈脂肪酸化合物(VLCFAs): 利用質體生成的C16或C18脂肪酸和丙二酰輔酶A (CoA)作為底物, 通過脂肪酸延伸酶(FAE)復合物, 在KCS、KCR、HCD和ECR四種酶的催化下循環(huán)反應生成C20～C34化合物[5]; 第三, 生成的VLCFAs經過不同的蠟質合成途徑生成不同的化合物。

植物中普遍存在兩條蠟質生物合成途徑, 包括烷烴合成途徑(也叫脫羰途徑)和醇合成途徑(也叫?；€原途徑)。前者通過CER1、CER3和CYTB5復合物催化由醛生成烷烴, 繼而通過中鏈烷烴羥化酶1 (MAH1)生成仲醇和酮[6]; 后者通過脂肪酸?；o酶A還原酶(CER4/FAR3)和蠟合酶/二酰基甘油?；D移酶(WSD1)分別產生初級醇和蠟酯[7-8]。小麥不同于其他植物, 在生殖生長階段有一條獨特的蠟質生物合成途徑: β-二酮途徑[9]。β-二酮主要為正十三烷-14,16-二酮, 由于β-二酮的存在, 絕大多數(shù)現(xiàn)代小麥(L.)品種表現(xiàn)出白霜狀蠟質外觀[10-11]。近期研究證實小麥中負責β-二酮的生物合成的位點是一個合成基因簇, 分別編碼III型的聚酮合成酶、一個細胞色素P450和一個水解酶/羧化酯酶[12]。不同蠟質化合物從內質網合成以后轉移到質膜(PM), 然后由ABCG轉運蛋白穿過PM, 最后脂質轉運蛋白(LTP)參與穿過外周細胞壁轉移到角質層表面, 自我組裝成肉眼可見的白霜狀表皮蠟質層[13-14]。

前期我們利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變小麥品種濟麥22獲得一個穎殼蠟質缺失突變體, 命名為突變體, 并對其進行了表型鑒定、遺傳分析和精細定位。GC-MS測定結果顯示, 與野生型相比, 突變體的總蠟質含量和單個蠟組分含量均發(fā)生顯著變化, 特別是突變體中β-二酮含量顯著高于野生型[15]。為了闡明潛在的分子機制, 本文對濟麥22和抽穗期的穎殼進行了轉錄組比較分析。研究結果揭示了基因調控小麥蠟質合成代謝相關基因的可能的分子機制, 為構建蠟質代謝表達調控網絡提供理論依據(jù), 同時也為進一步選育抗逆小麥品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥突變體是由小麥優(yōu)質栽培品種濟麥22經EMS誘變所得, 經連續(xù)自交, 已純合一致, 能穩(wěn)定遺傳。相較于野生型,突變體的穗部穎殼明顯表現(xiàn)為光滑無蠟(圖1)。2017年秋季, 在北京上莊(116°E, 40°N)分別種植濟麥22和突變體, 并設置3個重復(3行/重復)。播種時行長1.5 m, 間距0.3 m, 籽粒均勻分布, 每行播種率為20粒。

圖1 濟麥22和glossy1突變體的表型比較

A: 濟麥22和突變體的整株表型, 標尺為1 cm; B: 穗子放大圖, 標尺為1 cm。

A: The whole plant of Jimai 22 and.Bar: 10 cm; B: Enlarged view of spikes of Jimai 22 and.Bar: 1 cm.

1.2 總RNA提取和測序

2018年夏季, 于小麥開花期(GS65)收集野生型和突變體小麥穎殼組織, 并迅速置于液氮罐中, 作為后續(xù)轉錄組測序的樣品。本研究對6個樣品進行分析, 分別是突變體的3個生物學重復(命名為Rep1、Rep2和Rep3), 野生型濟麥22的3個生物學重復(Jimai 22 Rep1、Rep2和Rep3)。液氮研磨樣品, 利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取穎殼總RNA, 具體方法參照說明書。完成總RNA提取后, 組織樣品送至北京貝瑞和康生物技術有限公司利用HiSeq2000儀器完成文庫構建、質量控制及轉錄組測序。

1.3 差異表達基因的鑒定

測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw data), 去除接頭序列和低質量測序片段之后, 獲得高質量的序列(Clean data)。將Clean data與小麥參考基因組(Chinese Spring, RefSeq v.1.1)進行比對, 獲取基因組位置信息。使用RSEM軟件包評估基因表達水平。使用FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)方法標準化基因的表達水平[16]。使用DESeq R package[17], 使用調整后的值(FDR < 0.05)和Fold Change (FC)比值(|log2FC|≥1)來確定突變體和野生型之間的差異表達基因(DEGs)。

1.4 RT-qPCR驗證差異表達基因

根據(jù)樣品基因表達量差異, 本實驗隨機挑選9個基因(;;;;;;;;)進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)驗證。吸取1 μg總RNA使用反轉錄試劑盒HiScript II RT SuperMixqPCR (Vazyme)試劑盒合成cDNA第1鏈。以(TraesCS5D02G132200)作為內源性對照校準基因表達水平。RT-qPCR的引物對列于表1。qPCR使用SYBR Green PCR Master Mix (Vazyme Biotech, Ltd., China)和CFX96 Real-time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)進行。RT-qPCR反應條件為: 95℃預變性3 min, 95℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸30 s設置40個循環(huán), 在72℃延伸30 s階段采集熒光, 并添加溶解曲線, 結果用2–ΔΔCt計算基因表達差異[18]。本實驗包含3次生物學重復, 每個生物學重復進行3次技術重復。

1.5 差異表達基因的注釋

為進一步了解差異表達基因(DEGs)的生物學意義, 本研究使用FDR<0.05作為篩選標準對DEGs進行基因本體論(GO)富集分析[19]。具體分析流程使用中國農業(yè)大學小麥研究中心生信分析平臺中小麥族同源基因注釋數(shù)據(jù)庫Triticeae-Gene Tribe板塊中的GoEnrichment功能模塊進行分析[20]。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數(shù)據(jù)質控

為了闡明濟麥22背景的突變體穗部蠟質缺失性狀的分子基礎, 我們選取兩親本開花期的穎殼為材料提取總RNA, 進行了轉錄組測序(RNA-seq)。每個基因型設置3個生物學重復, 剔除低質量的測序reads后, 將每個樣本的高質量reads比對到小麥中國春參考基因組(RefSeq v.1.1)上。結果顯示, 每個樣本的測序原始數(shù)據(jù)分別從73.17 M到91.29 M不等。經過質量過濾后, 每個樣本產生52.12 M到64.66 M干凈讀長, 這些讀長在參考基因組的比對率均達70.80%以上(表2)。同組樣品基因表達模式趨于一致且Pearson相關系數(shù)均大于0.80 (圖2-A)?？偟膩碚f, 這些結果均驗證了RNA和測序數(shù)據(jù)的高質量, 可以進行后續(xù)分析。

表1 RT-qPCR所用引物

表2 樣品測序輸出數(shù)據(jù)的質量評價

2.2 差異表達基因分析

為了確定野生型和突變體之間基因表達的差異,根據(jù)FPKM值對基因表達水平進行標準化。所有的唯一映射讀取被用來計算基因FPKM值。根據(jù)DESeq2分析結果, 以adjusted-value < 0.05且Fold-change value > 2 或者 < 0.5作為標準進行篩選, 共篩選出12,230個差異表達基因(DEGs), 占檢測到基因總數(shù)的26.6%。相較于濟麥22, 5811個基因(占總DEGs的47.5%)在突變體中上調表達, 6419個基因(占總DEGs的52.5%)在突變體中下調表達(圖2-B)。進一步對12,230個差異表達基因的染色體分布進行了統(tǒng)計, 結果發(fā)現(xiàn)差異表達基因在A、B和D基因組上的分布基本是均勻的(圖2-C)。

2.3 RT-qPCR驗證

為了驗證我們轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 我們隨機選擇了9個差異表達基因進行實時熒光定量PCR的檢測。實時定量PCR的結果與轉錄組數(shù)據(jù)的結果變化趨勢比較一致(圖3), 說明我們轉錄組數(shù)據(jù)有很高的可靠性。

2.4 差異表達基因GO富集分析

為了解濟麥22和差異表達基因的生物學意義, 按照錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05的標準對這些基因進行基因本體論(gene ontology, GO)富集分析。對12,230個差異表達基因進行GO功能注釋和分析發(fā)現(xiàn), 共有5380個基因獲得注釋, 分布于159個GO分類條目。根據(jù)基因數(shù)目分別篩選出30條最顯著的條目(圖4-A)。在三類注釋生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)中所占的比例分別為46.5% (74)、8.2% (13)和45.3% (72)。在生物學過程中, 以抗氧化過程(response to oxidative stress)的基因數(shù)最多, 脂肪酸生物合成過程(fatty acid biosynthetic process)以及脂質轉運(lipid transport)等生物學過程的基因數(shù)目占很大比例。分子功能注釋的基因大部分集中在水解酶活性(hydrolase activity)、轉移酶活性(transferase activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)以及脂質結合(lipid binding)等。在細胞組分中, 質膜(plasma membrane)功能組擁有的基因數(shù)最多。

圖2 樣品相關性及差異表達基因分析

A: 樣品相關性分析; B: 差異表達基因火山圖; C: 差異表達基因在染色體上的分布。

A: correlation analysis among the samples; B: volcano plot of DEGs; C: the distribution of DEGs on wheat chromosomes.

圖3 RT-qPCR驗證隨機挑選的DEGs

為進一步研究小麥穎殼蠟質調控基因的生物學功能, 分別將上調和下調的差異表達基因進行GO富集分析, 根據(jù)基因數(shù)目分別篩選出30條最顯著的條目。結果表明, 上調DEGs主要富集在跨膜轉運活性(transmembrane transporter activity)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)以及?；D移酶活性(transferase activity, transferring acyl groups)等條目(圖4-B); 下調DEGs中分子功能模塊基因數(shù)目最多的條目是水解酶活性(hydrolase activity)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)以及脂質結合(lipid binding) (圖4-C)。

圖4 差異表達基因的GO功能注釋

A: 差異表達基因的GO功能注釋分類; B: 上調DEGs的GO富集; C: 下調DEGs的GO富集。

A: GO functional annotation classification of DEGs; B: GO enrichment of up-regulated DEGs; C: GO enrichment of down-regulated DEGs.

2.5 表皮蠟質合成及轉運途徑相關基因的表達

表皮蠟質是由多種蠟質化合物組成的, 它的合成需要多步反應。為了從轉錄組角度分析參與的蠟質代謝途徑, 我們結合前人的報道繪制了表皮蠟質合成和轉運途徑示意圖(圖5)。從圖中我們發(fā)現(xiàn)以3-酮酯酰-ACP為底物合成β-二酮途徑中涉及的α/β水解酶基因()、查爾酮合酶基因()以及催化羥基β-二酮合成的細胞色素P450基因()在突變體中都上調表達, 這可能導致了突變體中β-二酮含量相對于野生型的顯著增加。在合成VLCFAs過程中涉及的長鏈?；o酶A合成酶基因()以及脂肪酸延伸酶復合物中的成員3-酮酰-輔酶A合成酶基因()的表達水平既有上調也有下調, 然而β-羥烷基-輔酶A脫水酶基因()在突變體中上調表達。?；€原和脫羰途徑共有的脂肪酸?；?輔酶A還原酶基因()在突變體中大部分下調表達, 少部分基因上調表達; 復合物CER1、CER3和CYTB5三者共同作用催化烷烴的合成, 前者涉及的基因在突變體中大部分上調表達, 而后兩者均下調表達; 催化初級醇生成蠟酯的O-酰基轉移酶家族蛋白基因的表達水平既有上調也有下調。長鏈脂肪酸及衍生物合成后, 從質膜轉運到細胞外間隙過程中涉及的ABC轉運G家族蛋白基因()的表達水平在突變體中既有上調也有下調表達, 轉運蠟質化合物穿過細胞壁到達角質層外面的脂質轉移蛋白基因()在突變體中均下調表達(表3)。這些結果表明在小麥蠟質合成和轉運過程中具有非常重要的作用。

為了全面了解調控小麥蠟質代謝的相關途徑, 我們根據(jù)前人的報道, 進一步在突變體和野生型開花期的穎殼中用RT-qPCR方法檢測了五個代謝途徑共43個基因的表達情況, 其中25個基因表達水平發(fā)生了顯著變化, 包括9個脂肪酸延伸途徑基因、4個?；€原途徑基因、8個脫羰途徑基因、2個轉運途徑基因以及2個調控途徑基因(圖6)。結果表明脂肪酸延伸途徑、轉運及調控途徑的基因幾乎都下調表達, 而?；€原及脫羰途徑的基因既有上調表達也有下調表達, 這與本實驗的轉錄組結果也是一致的。

表3 小麥穎殼中蠟生物合成途徑相關的差異表達基因

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

圖5 小麥蠟質生物合成示意圖

不同顏色的字體表示已知或推測的在表皮蠟質生物合成步驟中起作用的基因表達水平的變化, 其中紅色代表突變體相對野生型基因表達上調, 橘色代表這類基因表達水平既有上調也有下調, 藍色代表下調。

The colored fonts indicate transcriptional changes of the genes known or predicated to be central for epicuticular wax biosynthesis.Compared with the wild-type, the relative expression of the genes in red is up-regulated, the expression of the genes in orange is up-regulated and down-regulated, and the expression of the genes in blue is down-regulated.

圖6 突變體glossy1相對濟麥22蠟質基因的轉錄變化

*:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001。

3 討論

轉錄組測序(RNA-Seq)技術能夠從整體水平研究基因表達差異以及基因結構, 與其他技術手段結合可以解析特定的生物學過程, 已被廣泛應用于植物候選基因發(fā)掘、功能鑒定及遺傳改良等領域。2017年, Huang等利用轉錄組測序等手段揭示了小麥表皮蠟質合成抑制基因的本質是長鏈非編碼RNA, 并驗證了它作為顯性抑制因子對蠟質合成基因的調控功能[21]。2021年1月,期刊發(fā)文揭示了水稻適應土壤低氮的機制, 研究人員通過多個轉錄組的交叉比較分析, 從數(shù)百個候選基因中發(fā)現(xiàn)15個可能受OsTCP19直接調控且與N響應相關的基因, 這為研究的突破性進展指定了正確的方向[22]。

植物表皮蠟質對抵抗外界環(huán)境中生物(病原菌、昆蟲等)和非生物(干旱、紫外線等)脅迫具有非常重要的作用。目前在小麥中已定位的表皮蠟質基因比較少, 主要包括控制蠟質合成位點～, 抑制蠟質合成位點～, 其中已經克隆的只有兩個:和[12,21,23]。因此, 挖掘新的表皮蠟質基因對培育新的小麥抗逆品種是非常重要的。本研究在已定位的穎殼蠟質缺失突變體的基礎上開展, 通過對濟麥22和突變體開花期的穎殼進行轉錄組測序, 旨在從轉錄組水平上揭示突變體中蠟質含量變化的分子機制, 為進一步確定和克隆該基因提供依據(jù), 同時也有助于從全基因組水平上發(fā)掘對小麥蠟質代謝有重要作用的功能基因, 為抗逆小麥育種奠定理論基礎。

β-二酮是大麥和小麥等小麥族作物表皮蠟質特有的成分, 在擬南芥和其他作物中檢測不到, 它的產生決定了普通小麥植株表面呈現(xiàn)白霜狀的外觀[24-25]。前人已經報道了穗部蠟質合成抑制位點是由于β-二酮的缺失導致穎殼光滑無蠟表型[11]。而本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)與β-二酮合成相關的基因、和在突變體中均上調表達, 這雖然解釋了突變體中穎殼的β-二酮含量相較野生型顯著增加的結果, 但是與前人報道的由于β-二酮的缺失導致穎殼光滑無蠟的表型是相悖的。因此深入研究調控機制對于完善小麥蠟質合成代謝機制是很有幫助的。

植物表面白霜狀表層是由表皮細胞內質網合成的各種脂質化合物轉運到質膜, 再穿過外周細胞壁轉運到角質層后自我組裝形成的蠟質層。2011年, 陳國雄等克隆了編碼ABC轉運蛋白G亞家族的一個全轉運子HvABCG31的角質層基因, 該基因的功能缺失會導致脂質成分在葉片表皮細胞的大量積累, 導致葉片表面角質層變薄, 角質含量減少[26]。擬南芥中的脂質轉運蛋白LTPG參與角質的合成, 該基因突變導致莖表皮細胞角質層蠟質組成發(fā)生變化以及蠟質積累減少[14]。此外, 煙草中基因表達量上升, 可使葉片的角質層蠟質積累增加[27]。本研究中ABC轉運G家族蛋白基因()和脂質轉移蛋白基因()的表達水平在突變體中大部分呈下調表達, 這很可能造成脂質化合物在表皮細胞中積累, 從而導致突變體穎殼蠟質減少。因此, 進一步對蠟質合成及轉運途徑基因的研究將有助于明確突變體穎殼蠟質缺失的產生原因及潛在的分子機制。

4 結論

本研究利用轉錄組測序技術系統(tǒng)分析了小麥突變體和野生型穎殼的轉錄組。通過比較突變體和野生型間的表達水平, 發(fā)現(xiàn)了12,230個差異表達基因, 其中5811個基因在突變體中上調表達, 6419個下調表達。通過功能注釋分析發(fā)現(xiàn), 這些差異基因主要涉及?；D移和脂質結合等途徑, 這些關鍵基因的表達水平變化可以解釋突變體相較于野生型穎殼蠟質含量的顯著變化。本文通過轉錄組測序的方法揭示了突變體蠟質代謝調控基因的轉錄圖譜, 為深入了解基因功能和小麥蠟質代謝的分子機制及基因調控網絡提供了數(shù)據(jù)信息。

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Transcriptome profiling ofmutant with glossy glume in common wheat (L.)

LI Ling-Hong, ZHANG Zhe, CHEN Yong-Ming, YOU Ming-Shan, NI Zhong-Fu, and XING Jie-Wen*

College of Agronomy, China Agricultural University, Beijing 100193, China

In order to clarify the molecular mechanism of the significant change in glume wax content, transcriptome profiling was performed on glossy glume mutantand its wild-type Jimai 22.The results showed that a total of 12,230 differentially expressed genes were screened in themutant, among which 5811 genes were up-regulated and 6419 were down-regulated.GO functional enrichment revealed that the differentially expressed genes were mainly enriched in the wax synthesis and transport pathway, specifically distributed in acyltransferase activity, lipid binding, hydrolase activity.The findings suggested that these pathways were closely related to the glume-wax-deficient trait in wheat.We also detected the relative expression levels of some genes involved in the wax metabolic pathway by RT-qPCR, and the results were consistent with the transcriptome data.This study not only provides data support for the further study of the molecular mechanism of wax metabolism and gene regulation network but also lays a theoretical foundation for the breeding of stress-resistant variety in wheat.

wheat; epicuticular wax;mutant; transcriptome analysis; molecular mechanism

2021-01-12;

2021-04-14;

2021-05-21.

10.3724/SP.J.1006.2022.11006

通信作者(Corresponding author): 邢界文, E-mail: Jiewen.Xing@cau.edu.cn

E-mail: lilinghong00en@163.com

本研究由國家自然科學基金項目(31991214)和國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0101004)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31991214) and the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101004).

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210521.1245.002.html