王超 姜鑫 矯筱蔓 陳權(quán)

【關(guān)鍵詞】UPLC-MS/MS；中藥制劑；非法添加；抗組胺類藥物

中藥凝聚了中華民族數(shù)千年的智慧，在我國有著悠久的歷史，深受患者的青睞[1-2]。近年來，一些不法商家為了謀求利益，在中藥制劑中非法添加化學(xué)藥品的情況時有發(fā)生[3-4]。這可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至可能會危害到患者的健康和生命安全[5-6]。因此，國家藥品監(jiān)督管理總局頒布了一系列針對非法添加的補(bǔ)充檢驗方法。目前，已報道的抗組胺類藥物的檢測方法多為液相色譜法[7-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10]，但超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法以其專屬性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于中藥制劑中非法添加的檢測[11-15]。本文選取13 種常用的抗組胺類藥物，采用UPLC-MS/MS法建立中藥制劑中非法添加的抗組胺類藥物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曲吡那敏、溴苯那敏來自LGC公司，氯苯那敏、苯海拉明、地氯雷他定、異丙嗪、阿司咪唑、賽庚啶、羥嗪、西替利嗪、氯丙嗪、特非那定、氯雷他定來自中國食品藥品檢定研究院。

甲醇為色譜純；甲酸、甲酸銨均為質(zhì)譜級；水為超純水。中藥制劑樣品均為市售樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

XEVO TQ超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；XPE205DR電子天平（梅特勒-托尼多儀器有限公司）；Milli -Q Advantage A10 超純水儀（美國Millipore 公司）；AS3120A超聲清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×150mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；流動相A 為10 mmol/L 甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，流動相B 為甲醇，梯度洗脫（0～2 min，45%B；2～8 min，45%～60% B；8～12.5 min，60%～75% B；12.5～13min，75% B～95% B；13～16 min，95% B；16.5～20 min，45% B）；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），毛細(xì)管電壓：4.0 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/Hr；錐孔氣流速：50 L/Hr；碰撞氣流速：0.15 mL/min。

1.3.3 對照品儲備液的制備

精密稱取各對照品約10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度約為1 mg/mL的對照品儲備液。分別精密吸取各對照品儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成1 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.4 供試品溶液的制備

取樣品約1 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加入甲醇45mL，超聲提取10 min，放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，混合搖勻，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別考察水、0.1%甲酸水及10 mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸三種水溶液作為水相的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水相為純水時，部分色譜峰峰型較寬，拖尾嚴(yán)重；當(dāng)體系中加入酸時，可增加各組分的響應(yīng)，峰型也得到了一定的改善，但部分組分保留時間過短；使用甲酸銨-甲酸體系作為水相，可明顯抑制拖尾現(xiàn)象，且保留時間合適。分別考察甲醇和乙腈兩種溶劑作為有機(jī)相的分離效果，結(jié)果表明兩種溶劑的分離效果相差不大，考慮到供試品溶液的提取溶劑為甲醇，故采用10 mmol/L 甲酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用100 ng/mL的混合對照品溶液以流動注射的方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。正離子模式下采用一級質(zhì)譜掃描方式進(jìn)行母離子掃描，確定各組分的準(zhǔn)分子離子峰，并對錐孔電壓進(jìn)行優(yōu)化；對待測物的分子離子進(jìn)行子離子全掃描，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，選取豐度最強(qiáng)的碎片離子作為定量離子，次強(qiáng)的碎片離子作為定性離子，不同組分質(zhì)譜分析條件見表1。

2.3 樣品前處理的選擇

試驗通過比較不同的提取溶劑（甲醇、乙腈），不同溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（50%、75%、100%）以及不同超聲時間（5 min、10 min、15 min）對加標(biāo)樣品的提取效率進(jìn)行考察。結(jié)果表明，超聲時間延長對提取效率的影響不大，但隨著提取溶劑中有機(jī)相比例減少，提取效率稍有降低；甲醇和乙腈的提取效率相差不大，由于對照品是用甲醇溶解，故選擇甲醇作為提取溶劑超聲10 min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗

取混合對照品溶液（10 ng/mL）按“1.3.1”和“1.3.2”項下的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣、測定，色譜圖見圖1。取不含任何化學(xué)成分的中藥制劑按“1.3.4”項的方法處理并測定，陰性樣品色譜圖上均無干擾。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

用甲醇將混合對照品溶液稀釋成一系列質(zhì)量濃度（ng/mL）分別為2、5、10、20、50 的線性溶液，進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，各組分在其線性范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，見表2。

2.4.3 檢出限和定量限

取混合對照品溶液，用甲醇逐級稀釋后進(jìn)樣分析，按信噪比為3（S/N=3）計算檢出限（LOD），按信噪比為10（S/N=10）計算檢定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

2.4.4 加標(biāo)回收試驗

以不含任何化學(xué)成分的中藥制劑為基質(zhì)，采用3 個質(zhì)量濃度（2.5、5、25 ng/mL）添加混合對照品溶液，按“1.3.4”項下方法處理并測定，計算不同組分的加標(biāo)回收率，結(jié)果表明，各組分的加標(biāo)回收率在91.1%～101.3%之間，RSD均小于5%，見表3。

2.4.5 精密度試驗

取混合對照品溶液（10 ng/mL），連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算峰面積的RSD，結(jié)果表明，各組分的精密度RSD均小于2.5%，見表3，說明儀器具有較好的精密度。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

取加標(biāo)回收試驗樣品溶液（5 ng/mL），在配制后分別放置0、2、4、8、12、24 h，進(jìn)樣測定，計算各組分含量的RSD，結(jié)果表明，各組分的穩(wěn)定性RSD均小于5%，見表3，說明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 樣品測定

按擬定的含量測定方法，對10 批市售中藥制劑進(jìn)行測定，均未檢出上述組分。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了13 種抗組胺類組分的定性、定量分析方法。所建方法前處理方法簡單、準(zhǔn)確、靈敏，專屬性強(qiáng)，分析時間短，可用于中藥制劑中非法添加抗組胺類組分的檢測，可為藥品監(jiān)管部門提供技術(shù)支撐。