劉鵬飛 麥嘉埼 劉 君 李坪遙 周捷成 蔣 鋒*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣州 510225；2.廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點實驗室，廣州 510225)

小麥 (Triticumaestivum) 是我國主要糧食作物之一，高活力種子是作物高產(chǎn)的基本保障。小麥種子活力會直接影響種子的發(fā)芽、田間出苗、生長狀況及最終產(chǎn)量[1-2]。盧麗娟等[3]研究表明播種前對小麥種子進行預(yù)處理，可提高種子的發(fā)芽率。種子包衣技術(shù)和其他化學(xué)物質(zhì)處理可提高小麥種子萌發(fā)與生長發(fā)育，抑制病原菌，但以農(nóng)藥為主成分的種衣劑的施用常會污染環(huán)境、危害人畜安全[4-6]。

利用超聲波等物理方法提高種子活力，因具有操作簡便、省時有效、安全環(huán)保等特點而被廣泛用于種子播前處理，可使種苗長勢一致，增強對逆境脅迫的適應(yīng)，從而提高抗逆性和產(chǎn)量[7-8]。將水稻種子置于超聲波場中，超聲波的空化作用可以刺激細胞壁產(chǎn)生微孔或微裂縫，有利于細胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，促進種子發(fā)芽[9]。Aladjadjiyan[10]研究表明，超聲波處理可顯著提高小麥種子的發(fā)芽率，還能使幼苗的根長、莖長與總鮮重顯著增加，提高種子細胞中酶的活性，刺激細胞初級代謝的生物合成，幫助植物在遭受脅迫時減輕體內(nèi)活性氧(ROS)對機體的危害。Chen等[11]研究表明，超聲波處理后可顯著提高小麥幼苗體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽還原酶(GR)的活性，還能顯著提高體內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的含量，從而顯著提高種子活力和抗逆性。通過超聲波處理白菜種子可顯著提高發(fā)芽率，出苗快而整齊[12]；以40 kHz超聲波處理黃豆種子可以顯著提高種子的萌發(fā)率，同時可改善產(chǎn)出的黃豆品質(zhì)與營養(yǎng)價值[13]；采用超聲波處理油菜種子，可以打破種子的休眠，并能顯著促進種子發(fā)芽及提高種子生長指數(shù)[14]。

目前，有關(guān)超聲波提高小麥種子活力的研究大都集中在超聲波對種子萌發(fā)[15]、生長發(fā)育[16]及產(chǎn)量[11]的影響，主要通過相關(guān)的生理指標來揭示超聲波對種子活力的影響。針對超聲波促進小麥種子活力分子機理的研究尚未見報道。本研究以小麥品種‘濟麥22號’為試驗材料，研究不同超聲波處理時長對小麥種子活力和幼苗生長的影響，并基于RNA-Seq技術(shù)對促進小麥種子活力效果最顯著的超聲波處理與對照組進行比較，篩選與小麥種子活力相關(guān)的差異表達基因，進行GO分類及KEGG富集分析，旨在研究超聲波處理對小麥種子活力相關(guān)基因表達與調(diào)控的影響，以期為解析超聲波促進小麥種子活力的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為國審品種‘濟麥22號’(國審麥2006018)，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。選取大小一致、顆粒飽滿的小麥種子為供試材料。

1.2 試驗方法

1.2.1種子預(yù)處理

室溫下，將小麥種子用網(wǎng)袋包好，清水浸泡4 h后，用超聲波處理種子。試驗設(shè)置0(CK)、10、20、30、40和50 min共 6 個超聲波時長處理，每個處理設(shè) 3 次重復(fù)，每重復(fù) 100 粒種子，以浸種但未超聲波處理(0 min)的種子為對照(CK)。超聲波清洗儀(KQ3200E型，40 kHz，150 W)為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2.2萌發(fā)試驗

采用培養(yǎng)皿濾紙法對小麥種子進行萌發(fā)試驗(GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》[17])。每天統(tǒng)計種子的發(fā)芽情況，以胚根長0.5 mm為萌發(fā)標準。7 d后，測量統(tǒng)計全部正常發(fā)芽種子的苗長(SL)，稱量幼苗鮮重(SFW)，80 ℃烘至恒重，稱量幼苗干重(SDW)，性狀測定取3次測定平均值。用發(fā)芽率(GP)、活力指數(shù)(VI)、苗長、苗鮮重和苗干重為指標篩選顯著影響種子活力的超聲波處理時長進行下一步試驗。

發(fā)芽率=(萌發(fā)7 d全部發(fā)芽種子數(shù)/每處理供試種子數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)

(2)

式(2)中：Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，d。

活力指數(shù)(VI)=GI×S

(3)

式(3)中：S為試驗最后一天正常幼苗的平均苗長。

1.2.3生理指標的測定

超聲波處理0 min(CK)與處理30 min的小麥種子萌發(fā)0和72 h后，分別選取種子和胚芽進行各生理指標測定。游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法測定[17]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT還原法測定[18]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定[19]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定[19]。

1.2.4轉(zhuǎn)錄組測序分析

選取超聲波處理0 min(CK)與處理30 min后的小麥種子，分別于萌發(fā)0 h選取種子，72 h選取幼苗，每處理3次重復(fù)，進行轉(zhuǎn)錄組測序。由廣州基迪奧生物科技有限公司完成測序文庫的構(gòu)建，利用Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。

基于各樣本基因表達量結(jié)果，通過PCA分析和計算樣本間Pearson相關(guān)系數(shù)，考查樣品之間重復(fù)性。利用DESeq 2軟件對數(shù)據(jù)進行組間差異分析，篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因用于后續(xù)分析。利用GO數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology)和KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因的功能信息進行分析和挖掘。

1.2.5qRT-PCR分析

利用CFX 96 TouchTMReal Time System完成qRT-PCR。試劑盒采用Takara Prime Script RT Master Mix(Perfect Real Time)。利用Primer-Premier 5.0設(shè)計qRT-PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。熒光定量反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)程序參照Livak等[20]方法進行。每個樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔct法處理數(shù)據(jù)并制作基因相對表達量柱狀圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進行試驗數(shù)據(jù)的處理，利用SPSS 19.0軟件進行方差分析；熱圖及通路富集分析圖由微生信(http:∥www.bioinformatics.com.cn)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時長超聲波處理對小麥種子活力的影響

由表1可知，所有處理和對照的‘濟麥22號’種子發(fā)芽率均為100 %。與對照組(CK)相比，除了處理10 min的苗干重與CK無顯著差異，其余各處理的種子活力指數(shù)、苗長、苗鮮重和苗干重均顯著高于CK；其中超聲波處理時長為30 min的種子活力指數(shù)、苗長、苗鮮重和苗干重最高，見圖1。

表1 不同時長超聲波處理下小麥種子活力指標Table 1 wheat seed vigor index under different ultrasonic time treatment

圖1 超聲波處理0(CK)和30 min后萌發(fā)72 h的小麥苗長比較Fig.1 Comparison of seedling length of wheat treated with ultrasonic 0(CK) and 30 min after 72 h germination

WCK，超聲波處理0 min；WUL，超聲波處理30 min。**表示P≤0.01水平顯著。下同。WCK,without ultrasonic treatment；WUL,ultrasonic treatment for 30 min.** represent significant differences at P≤0.01 levels.The same below.圖2 不同萌發(fā)時間小麥種子的Pro(a)、SOD(b)、POD(c)和CAT(d)的變化Fig.2 Changes of Pro (a),SOD (b),POD (c) and CAT (d) of wheat seeds at different germination time

2.2 超聲波處理對小麥種子活力相關(guān)生理指標的影響

由圖2可知，30 min超聲波處理后種子萌發(fā)0 h時，種子內(nèi)的Pro含量及SOD、CAT、POD活性均極顯著高于對照(CK)。萌發(fā)72 h時，30 min超聲波處理的種子Pro含量、SOD與CAT活性均極顯著高于CK，而POD活性與CK無顯著差異。因此，超聲波處理30 min能提高種子體內(nèi)Pro含量、POD、SOD和CAT活性，酶活性的增加充分說明小麥種子活力提高了。

2.3 超聲波處理下小麥種子活力的轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.3.1小麥種子活力相關(guān)基因差異表達分析

由圖3可知，相同處理條件下3個生物學(xué)重復(fù)間各個基因的表達量無顯著差異，可進行下一步分析。0 min超聲波處理小麥種子萌發(fā)0 h的對照組(WCK-1)與30 min超聲波處理種子萌發(fā)0 h(WUL-1)間無顯著差異；而萌發(fā)72 h后，0 min超聲波處理對照組(WCK-2)與30 min超聲波處理組(WUL-2)間差異顯著。綜上，30 min超聲波處理種子萌發(fā)72 h的種子活力相關(guān)基因表達與對照(0 min)差異顯著。

WCK-1-1、WCK-1-2、WCK-1-3為CK萌發(fā)0 h的3次重復(fù)；WUL-1-1、WUL-1-2、WUL-1-3為超聲波處理30 min后萌發(fā)0 h的3次重復(fù)；WCK-2-1、WCK-2-2、WCK-2-3為CK萌發(fā)72 h的3次重復(fù)；WUL-2-1、WUL-2-2、WUL-2-3為超聲波處理30 min后萌發(fā)72 h的3次重復(fù)。下同。WCK-1-1,WCK-1-2,and WCK-1-3 are 3 repetitions of 0 h germination in control group (CK)；WUL-1-1,WUL-1-2,and WUL-1-3 are 3 repetitions of 0 h germination in the 30 min ultrasonic treatment group；WCK-2-1,WCK-2-2 and WCK-2-3 are 3 repetitions of 72 h germination in control group (CK)；WUL-2-1,WUL-2-2 and WUL-2-3 are 3 repetitions of 72 h germination in the 30 min ultrasonic treatment group.The same below.圖3 基因表達相關(guān)性熱圖Fig.3 Heapmap of gene expression correlation

2.3.2小麥種子活力差異表達基因和qRT-PCR分析

由圖4可知，萌發(fā)0 h時，30 min超聲波處理與CK的小麥種子有70個差異表達基因，其中有15(21.43%)個基因表達上調(diào)、55(78.57%)個基因表達下調(diào)；萌發(fā)72 h時，幼苗有1 676個基因差異表達，其中有978(58.35%)個基因表達上調(diào)、698(41.65%)個基因表達下調(diào)(圖4)。超聲波處理30 min后的小麥種子萌發(fā)0 和72 h共有23個共有的差異表達基因(圖5)。30 min超聲波處理與CK的種子萌發(fā)0 與72 h時共有1 723個差異表達基因(圖5)。

從萌發(fā)72 h的30 min超聲波處理組與CK 1 653個差異表達基因中隨機選取了10個上調(diào)和10個下調(diào)的候選基因進行qRT-PCR分析。所有候選基因的 qRT-PCR表達譜與RNA-Seq表達譜一致(圖6)。

圖4 響應(yīng)超聲波處理的差異基因表達分析Fig.4 Differentially expressed gene analysis in response to ultrasound treatment

圖5 響應(yīng)超聲波處理的差異基因韋恩圖Fig.5 Venn diagram of differential genes in response to ultrasonic treatment

圖6 差異表達基因的qRT-PCR分析Fig.6 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes

2.3.3小麥種子活力差異表達基因的GO富集分析

與CK相比，超聲波處理30 min的小麥種子萌發(fā)0和72 h共有1 723個差異表達的基因(DEG)。對其進行GO注釋與富集分析，在生物過程、分子功能、細胞組分數(shù)據(jù)庫分別注釋10、6和4個二級條目(圖7)。在生物過程中，共富集了463個DEGs，主要涉及氧化還原過程、碳水化合物代謝過程、氧化應(yīng)激響應(yīng)與過氧化氫分解代謝過程，其中在氧化還原過程富集的差異基因數(shù)目最多，共186個；在細胞組分中，共富集了144個DEGs，主要涉及胞外區(qū)、質(zhì)外體、細胞壁和細胞外間隙等質(zhì)膜外區(qū)域；在分子功能中，共富集了216個DEGs，主要涉及氧化還原酶活性、單加氧酶活性和過氧化物酶活性(圖8)。綜上，以上差異基因的表達與超聲波處理有關(guān)，超聲波處理可以通過促進了上述代謝過程，從而提高種子活力。

2.3.4小麥種子活力差異基因的KEGG富集分析

由圖9可知，與CK相比，30 min超聲處理有174個差異基因可以高度匹配到KEGG數(shù)據(jù)庫中，差異表達基因主要富集在代謝通路上。富集最為顯著的3個通路依次為谷胱甘肽代謝(ko00480)、代謝途徑(ko01100)與色氨酸代謝(ko00380)，表明超聲波處理通過調(diào)控以上小麥種子基因表達的通路，從而提高小麥種子的活力。

圖7 小麥幼苗差異表達基因GO注釋分類Fig.7 GO annotation classification of DEGs in wheat seedlings

圖8 差異基因調(diào)控的顯著富集GO termsFig.8 Significantly enriched GO terms of DEGs

圖9 差異基因KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment plots of DEGs

圖10 谷胱甘肽代謝途徑基因表達熱圖Fig.10 Heat map of DEGs expression in glutathione metabolic pathway

2.4 谷胱甘肽代謝途徑基因的表達模式分析

由圖10可知，超聲處理30 min后小麥種子在0和72 h萌發(fā)過程中共有32個差異表達基因(DEGs)富集在谷胱甘肽代謝途徑上，萌發(fā)前僅有1個DEG與谷胱甘肽代謝途徑相關(guān)，萌發(fā)72 h后有32個DEGs富集到谷胱甘肽代謝途徑，其中萌發(fā)前1個DEG在2組時間點的表達差異顯著。對通路中的差異表達基因進行相關(guān)性分析，富集到谷胱甘肽代謝途徑中的差異基因均表達為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。小麥種子經(jīng)超聲處理30 min萌發(fā)72 h后，GST的表達量在對照組中較高，在超聲波處理組中表達較低。

3 討 論

種子活力是評價種子質(zhì)量的重要標準[21]。高活力種子能提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)及對逆境脅迫的抵抗，同時種子貯存時間長，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有明顯的優(yōu)越性。超聲波處理作物種子是一種經(jīng)濟、有效的物理方法。本研究對小麥品種‘濟麥22號’利用不同超聲波時長進行處理，結(jié)果表明，超聲波處理可以顯著促進小麥的種子活力指數(shù)、苗長、苗鮮重和苗干重，對發(fā)芽率沒有影響；Goussous等[16]對小麥種子通過超聲波處理30 min，使小麥發(fā)芽速度(GRI)較對照增加95%，但對發(fā)芽率(GP)影響較?。焕鑷驳萚22]利用超聲波刺激水稻種子，可顯著提高水稻種子的活力，主要原因是影響種子的萌發(fā)速度而不是影響萌發(fā)率；本研究與上述報道有類似的結(jié)果。趙艷軍等[15]以不同時長超聲波處理小麥種子，發(fā)現(xiàn)活力指標隨處理時間的延長先提高后降低，本試驗也有類似結(jié)果。Aladjadjiyan[10]研究表明，不同作物或同一作物的不同組織對超聲波的敏感性不同，超聲波對萌發(fā)率的影響也與種子本身的活力有關(guān)，對初始發(fā)芽率高的種子，其處理對種子活力沒有顯著提高[23]。本試驗可能由于供試材料初始發(fā)芽率高，超聲波處理對小麥發(fā)芽率沒有顯著影響，但顯著提高了其他活力相關(guān)指標，表明適當時長的超聲波處理可以提高小麥種子活力。

胡偉鳳等[23]研究表明，超聲波處理能顯著提高幼苗葉片中PRO含量，顯著提高水稻幼苗葉片和根系內(nèi)SOD和POD酶活性、葉片內(nèi)CAT活性，增強水稻的抗逆性。超聲波主要影響種子表面，產(chǎn)生熱效應(yīng)激活種子內(nèi)的不同代謝途徑，提高種子內(nèi)抗氧化酶的活性，促進體內(nèi)自由基的消除，維持種子萌發(fā)環(huán)境相對穩(wěn)定，從而提高種子活力[11、24-25]；本研究結(jié)果表明小麥種子經(jīng)超聲波處理30 min，能顯著提高PRO含量和抗氧化酶活性。余欣欣[24]研究表明，種子活力隨著POD、CAT活性提高而增強；本研究結(jié)果表明，超聲波處理30 min能顯著提高種子內(nèi)POD、SOD和CAT活性，在萌發(fā)72 h后除POD外，CAT、SOD活性還表現(xiàn)為顯著上升。楊曉玲等[26]利用超聲波處理小麥幼苗根系后，促進了幼苗的代謝活性，改變了根細胞的透性。因此，適當?shù)某暡ㄌ幚砜梢杂绊懛N子的細胞壁或細胞膜結(jié)構(gòu)，加速細胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，還能借助超聲波提升環(huán)境的溫度，促使植物體中抗氧化酶活性的提高，使自由基維持在較低水平，加快種子的萌發(fā)和生長。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可揭示植物中特定生物過程的分子機理，整體分析基因組的基因功能及表達差異，對分析復(fù)雜生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及構(gòu)建相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有重要的作用[27]。本研究對超聲波處理后的小麥種子共篩選到差異表達基因1 723個，主要富集到細胞質(zhì)或胞液中與氧化還原及碳水化合物相關(guān)的代謝途徑，說明超聲波處理可使小麥幼苗在萌發(fā)過程中產(chǎn)生氧化脅迫，觸發(fā)了體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，提高了小麥體內(nèi)碳水化合物的代謝，促進了種子的萌發(fā)，環(huán)境脅迫可以影響植物非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)代謝相關(guān)酶類的活性[28]。本研究中差異表達基因KEGG富集最為顯著的通路為谷胱甘肽代謝及色氨酸代謝等生物合成途徑。谷胱甘肽代謝可以維持細胞中ROS含量的穩(wěn)態(tài)、催化H2O2的轉(zhuǎn)化，保護細胞免受氧化脅迫；也可與其他生化代謝途徑相協(xié)同參與調(diào)節(jié)細胞中的谷氨酸、半胱氨酸的含量，為其他代謝途徑提供部分物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)控種子的萌發(fā)，特別在種子從露白到發(fā)芽階段發(fā)揮著重要作用[29]。崔歡等[28]利用轉(zhuǎn)錄組測序分析水稻種子萌發(fā)過程表明，差異表達基因主要富集在碳代謝、淀粉和蔗糖代謝與谷胱甘肽等途徑，并在谷胱甘肽代謝途徑中富集到編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的基因23個。本研究差異表達基因顯著富集在谷胱甘肽代謝途徑，該通路中富集的32個差異基因均編碼GST基因，對照組比超聲波處理組的GST基因表達量顯著升高，與崔歡等[28]研究具有相似的結(jié)果?？箟难?谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)是植物活性氧清除系統(tǒng)的重要組成部分[30]，還參與調(diào)節(jié)細胞中的谷氨酸和半胱氨酸的含量[31]；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)在植物種子萌發(fā)過程中可嚴格調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生與清除之間的平衡從而調(diào)控種子萌發(fā)[32-33]；張楠[34]研究表明，基因缺失會導(dǎo)致萌發(fā)種子中GSH含量的增加。

4 結(jié) 論

超聲波處理可顯著提高小麥的種子活力指標，處理時長30 min的效果最顯著；超聲波處理的小麥幼苗中脯氨酸含量以及SOD、CAT與POD的活性均顯著高于CK。轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，在生物過程上，超聲波處理對小麥種子活力的影響主要集中在氧化還原過程、碳水化合物代謝過程、氧化應(yīng)激響應(yīng)與過氧化氫分解代謝過程；在細胞組分上，主要集中在胞外區(qū)、質(zhì)外體、細胞壁和細胞外間隙等質(zhì)膜外區(qū)域；在分子功能上，主要集中在氧化還原酶活性、單加氧酶活性和過氧化物酶活性；富集最為顯著的3個通路分別為谷胱甘肽代謝、代謝途徑與色氨酸代謝，其中，谷胱甘肽代謝通路共富集32個差異表達基因(DEGs)。