顧怡瑾，李安琪，董 磊，謝嘉玲，袁 菲，王朝夫

膽道癌(biliary tract cancer, BTC)是一組具有高度異質(zhì)性的惡性上皮性腫瘤[1]。對(duì)常規(guī)放、化療不敏感，中位總生存期(median overall survival, mOS)約12個(gè)月[2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，揭示了膽道癌的高頻基因變異如TP53、KRAS和SMAD4等在疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用[3]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，有3.6%的BTC可檢測(cè)到乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)變異[4]，但國(guó)內(nèi)尚缺乏相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在開展膽道癌高通量測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)3例攜帶BRCA基因致病性變異的膽道癌(BRCA-mutant biliary tract cancers, BRCA-mutant BTC)，探討其臨床病理及分子病理學(xué)特征，有助于認(rèn)識(shí)其在臨床治療上的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年5月～2022年1月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院病理科經(jīng)高通量測(cè)序檢測(cè)的BTC 19例，經(jīng)生物信息分析篩選出3例BRCA-mutant BTC，并對(duì)患者進(jìn)行隨訪，末次隨訪時(shí)間2022年5月19日。

1.2 方法

1.2.1高通量測(cè)序檢測(cè) 采用QIAGEN QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取3例樣本腫瘤組織的石蠟基因組DNA，使用燃石生物公司OncoScreen Plus Panel檢測(cè)試劑盒制備文庫(kù)。通過NextSeq4 000(Illumina)平臺(tái)對(duì)基因組DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2基因組變異的生物信息分析解讀 根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)指南及共識(shí)[5-6]，對(duì)3例BTC進(jìn)行Ⅰ類(有較強(qiáng)臨床重要性的變異)和Ⅱ類(有潛在臨床重要性的變異)解讀。

1.2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證 采用QIAGEN QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取2例樣本的外周血基因組DNA，并針對(duì)檢測(cè)到的BRCA基因致病變異位點(diǎn)分別進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)[7]，以相應(yīng)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)BRCA基因參考序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征19例BTC行高通量測(cè)序并經(jīng)生物信息分析解讀，檢出3例BRCA基因致病性變異，確診為BRCA-mutant BTC。3例BRCA-mutant BTC中，例1、2為手術(shù)切除標(biāo)本，例1腫瘤位于膽囊底部，例2腫瘤侵及膽管壁及部分膽囊壁，切面均灰白色，質(zhì)中；例3腫瘤位于肝門部膽管，送檢為穿刺組織。3例組織學(xué)類型均為腺癌，例1(圖1)及例2組織學(xué)分級(jí)均為中分化，例2伴膽管旁及膽囊周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。相關(guān)臨床病理、治療及隨訪預(yù)后情況詳見表1。家庭史：例1患者姐姐和例2患者父親患有胰腺癌。

表1 3例BRCA-mutant BTC的臨床病理特征及隨訪

圖1 例1腫瘤組織HE染色：腺癌，中分化，細(xì)胞核增大，核仁突出，核分裂象增多

2.2 分子病理特征3例BRCA-mutant BTC分別檢出1例BRCA1和2例BRCA2基因致病性變異，均為截?cái)嗤蛔?，?及例2的腫瘤組織及外周血樣本經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，均為胚系變異(圖2)。同時(shí)，均檢出TP53基因不同位點(diǎn)的Ⅱ類變異。另例2還攜帶ARID1A、CDKN2A、FBXW7基因變異，例3攜帶PDGFRA基因拷貝數(shù)擴(kuò)增。腫瘤變異負(fù)荷(tumor mutation burden, TMB)值為5.98～12.96 Mut/Mb，均為腫瘤微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stable, MSS)(表2)。

表2 3例BRCA-mutant BTC的高通量測(cè)序

圖2 A.例1腫瘤組織測(cè)序BRCA2基因c.2095C>T導(dǎo)致p.Gln699*；B.例1外周血樣本測(cè)序基因變異同腫瘤組織

2.3 隨訪例1患者行化療，隨訪8個(gè)月，健在；例2患者行免疫治療聯(lián)合靶向治療，隨訪34個(gè)月，因BTC伴肝腹水死亡；例3患者行化療，隨訪37個(gè)月，因肝衰竭及BTC伴多部位淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移死亡。

3 討論

BRCA基因的致病性變異與乳腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，同時(shí)還是PARP抑制劑治療相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。Golan等[9]在研究膽管癌臨床特征時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA2基因致病變異的人群患BTC的風(fēng)險(xiǎn)增加，Hirosawa等[10]提出BRCA-1相關(guān)蛋白(BAP1)缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞侵襲。因此，BRCA-mutant BTC是BTC的特殊分子亞型。目前，PARP抑制劑已運(yùn)用于攜帶BRCA基因變異的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者，延長(zhǎng)其無進(jìn)展生存期，療效獲得肯定[11]。然而，其能否運(yùn)用于BTC中值得探究。

本組對(duì)19例BTC進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)3例BRCA-mutant BTC。由于樣本量較小，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，故本文針對(duì)這一分子亞型進(jìn)行國(guó)外文獻(xiàn)復(fù)習(xí)(表3)。國(guó)外研究者已在BTC中發(fā)現(xiàn)此分子亞型的胚系及體系變異，并已提出BRCA基因變異會(huì)影響B(tài)TC的DNA損傷修復(fù)[12]，與BTC易感性相關(guān)[13]，PARP抑制劑可能使此類患者得到更多的治療選擇。

表3 BRCA-mutant BTC國(guó)外文獻(xiàn)匯總

本組對(duì)3例BRCA-mutant BTC進(jìn)行總結(jié)，例2和例3患者均已為中晚期。臨床對(duì)3例患者分別進(jìn)行了不同的治療方式，例2和例3分別采用靶向治療聯(lián)合免疫治療和化療，兩者的總生存期差異不明顯(34個(gè)月和37個(gè)月)。因此對(duì)于中晚期BTC患者，建議盡早進(jìn)行高通量測(cè)序，尋找有效靶向基因。

BRCA-mutant BTC的胚系變異與體細(xì)胞變異有不同的側(cè)重點(diǎn)。胚系變異側(cè)重于遺傳疾病的致病性，會(huì)顯著增加BRCA基因相關(guān)腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；體細(xì)胞變異側(cè)重于對(duì)靶向藥物敏感性的判斷[5]。因此，明確BRCA-mutant BTC患者胚系或體細(xì)胞變異的臨床及分子遺傳學(xué)特征非常重要，在檢測(cè)出腫瘤BRCA致病性變異后，應(yīng)對(duì)患者的外周血或咽拭子樣本進(jìn)行采樣，以進(jìn)行更好的胚系遺傳評(píng)估。本文對(duì)例1和例2的腫瘤及外周血樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，均檢出BRCA基因變異，證實(shí)2例均為胚系變異。結(jié)合這2例患者均有一級(jí)親屬患胰腺癌的家族遺傳史，而胰腺癌患者的BRCA基因變異率為0～17%[14]。因此，具有BRCA基因胚系變異BTC患者，提示直系親屬患BRCA基因相關(guān)腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增高，應(yīng)對(duì)其直系親屬進(jìn)行遺傳咨詢及篩查，告知上述風(fēng)險(xiǎn)使其能提早預(yù)防。

本組3例BRCA-mutant BTC患者均檢出TP53基因變異，并提示了微衛(wèi)星狀態(tài)和TMB值。Valle等[15]發(fā)現(xiàn)BTC的TP53變異率為40%～59%，患者總生存期時(shí)間短，提示其變異是腫瘤發(fā)生及患者生存的高風(fēng)險(xiǎn)因素。Goeppert等[16]發(fā)現(xiàn)只有1.3%的BTC患者為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定。TMB閾值目前在BTC的不同研究中均有差異[17-18]。因此，本組3例BRCA-mutant BTC微衛(wèi)星狀態(tài)及TMB值尚不足以為臨床治療提供依據(jù)。

綜上所述，采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到BRCA-mutant BTC這一少見的BTC分子亞型，提示對(duì)于中晚期BTC患者基因檢測(cè)可以為臨床治療提供新方向。同時(shí)，區(qū)分胚系或體細(xì)胞BRCA基因變異對(duì)BRCA-mutant BTC尤為重要。