李榮崗，廖悅?cè)A，孫麗霞，黃秀芳，周 偉

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)，且中晚期子宮頸癌患者的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差[1-2]。因此，如何監(jiān)測(cè)子宮頸癌患者復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)估療效成為子宮頸癌治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)是指在腫瘤形成或進(jìn)展過(guò)程中從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，能夠真實(shí)反映腫瘤負(fù)荷，具有發(fā)展為轉(zhuǎn)移病變的潛力。CTC在1869年由Ashworth[3]首次發(fā)現(xiàn)，近十幾年來(lái)得到廣泛研究。目前，F(xiàn)DA唯一批準(zhǔn)的用于監(jiān)測(cè)腫瘤的臨床數(shù)據(jù)均為基于CellSearch獲得，且限用于乳腺癌[4]、結(jié)直腸癌和前列腺癌，而對(duì)于CTC檢測(cè)技術(shù)在子宮頸癌中應(yīng)用的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用基于親和性的免疫磁珠陰性富集方法聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)技術(shù)，通過(guò)回顧性分析健康女性志愿者和子宮頸癌患者外周血CTC，探討CTC與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步探討CTC檢測(cè)技術(shù)在預(yù)測(cè)子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移中的實(shí)用價(jià)值，從而為臨床醫(yī)師評(píng)估子宮頸癌患者預(yù)后提供更多可靠證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料隨機(jī)選取廣東省江門市中心醫(yī)院2016年1月～2017年12月經(jīng)病理證實(shí)的80例子宮頸癌手術(shù)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組納入研究，其中鱗狀細(xì)胞癌70例、腺癌10例?；颊吣挲g36～71歲，中位年齡53歲。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)2018版[5]子宮頸癌分期系統(tǒng)重新進(jìn)行分期。由于臨床上對(duì)早期(ⅠA～ⅡA期)和進(jìn)展期(ⅡB～Ⅳ期)子宮頸癌的治療方式不同，因此本研究將實(shí)驗(yàn)組劃為早期組和進(jìn)展組，分別為18例和62例。其余臨床信息經(jīng)電子病歷查詢獲得。因子宮頸癌患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移比例較高，故本實(shí)驗(yàn)隨訪結(jié)束時(shí)間為確診后24個(gè)月，隨訪結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移病例47例。另收集47例同期女性健康志愿者為對(duì)照組，年齡31～67歲，中位年齡50歲。本實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1CTC檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用基于親和性的免疫磁珠陰性富集聯(lián)合imFISH檢測(cè)受試者外周血CTC。熒光原位雜交樣品處理試劑盒購(gòu)自江蘇萊爾公司，所有操作規(guī)程及判讀標(biāo)準(zhǔn)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。受試者外周血采集應(yīng)用真空采血管采集肘正中靜脈血，為防止穿刺過(guò)程中上皮細(xì)胞污染，棄用前2 mL血，采集此后的4 mL靜脈血置于ACD抗凝管中。采集的血液樣本12 h內(nèi)去除血漿，裂解液去除紅細(xì)胞，磁珠孵育混勻去除白細(xì)胞，分離液分離富集腫瘤細(xì)胞。使用CD45抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，8號(hào)著絲粒探針進(jìn)行熒光原位雜交。使用奧林巴斯BX63熒光顯微鏡全自動(dòng)掃描閱片，并進(jìn)行人工復(fù)核。判讀標(biāo)準(zhǔn)：二倍體信號(hào)或CD45陽(yáng)性為淋巴細(xì)胞(圖1A、B)，≥三倍體且CD45陰性為腫瘤細(xì)胞(圖1C、D)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，以CTC計(jì)數(shù)≥2個(gè)/4 mL定義為CTC陽(yáng)性(圖1)。根據(jù)隨訪時(shí)間，CTC檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)為術(shù)后3、6、12和18個(gè)月，若病理組織學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)影像學(xué)確診患者發(fā)生復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移則停止檢測(cè)。

圖1 淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在熒光顯微鏡下的顯色模式：A.為淋巴細(xì)胞二倍體；B.為淋巴細(xì)胞CD45陽(yáng)性；C.腫瘤細(xì)胞8號(hào)著絲粒探針三倍體；D.腫瘤細(xì)胞8號(hào)著絲粒探針?biāo)谋扼w

1.2.2病理判讀 所有病理結(jié)果均由兩位高級(jí)病理醫(yī)師重新復(fù)核，對(duì)懷疑淋巴脈管侵犯的病例加做免疫組化CD31(EP78，即用型)和Podoplanin(D2-40，即用型)證實(shí)，兩種抗體均購(gòu)自北京中杉金橋公司，免疫組化染色采用Roche BENCHMARK-XT全自動(dòng)免疫組化儀，應(yīng)用EnVision兩步法染色。以病理組織學(xué)活檢和標(biāo)準(zhǔn)影像學(xué)作為判斷子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)分析。各組資料的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌患者外周血CTC與臨床病理特征的關(guān)系對(duì)實(shí)驗(yàn)組受檢者一般臨床病理資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同年齡、是否絕經(jīng)、病理組織學(xué)類型組間外周血CTC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)；而發(fā)生淋巴結(jié)侵犯和未發(fā)生淋巴結(jié)侵犯的CTC陽(yáng)性率分別為94.87%(37/39)和36.59%(15/41)，發(fā)生淋巴脈管侵犯和未發(fā)生淋巴脈管侵犯的CTC陽(yáng)性率分別為81.48%(44/54)和30.77%(8/26)，F(xiàn)IGO分期Ⅰ～ⅡA和ⅡB～Ⅳ的CTC陽(yáng)性率分別為44.44%(8/18)和70.96%(44/62)，提示發(fā)生淋巴結(jié)侵犯和脈管侵犯及臨床分期越高的患者，CTC陽(yáng)性率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 子宮頸癌患者外周血CTC與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)組有無(wú)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者外周血CTC的差異對(duì)照組外周血CTC陽(yáng)性率為4.26%(2/47)，2例陽(yáng)性患者經(jīng)人HPV檢測(cè)、陰道鏡及腹部超聲檢查，并行子宮頸活檢，診斷為子宮頸慢性炎及子宮肌瘤，未發(fā)現(xiàn)子宮頸惡性病變；實(shí)驗(yàn)組外周血CTC陽(yáng)性率為65.0%(52/80)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.073，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組有復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移和無(wú)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的外周血CTC陽(yáng)性率分別為93.62%(44/47)、24.24%(8/33)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.022，P<0.001)。通過(guò)ROC分析其曲線下面積達(dá)0.803，說(shuō)明具有良好的特異性(P<0.001，圖2)。

圖2 健康志愿者和子宮頸癌患者CTC檢測(cè)的ROC分析

3 討論

2018年WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全球子宮頸癌每年新發(fā)病例近57萬(wàn)，死亡病例約31.1萬(wàn)例，其中我國(guó)每年新發(fā)子宮頸癌病例10.6萬(wàn)，死亡病例約4.8萬(wàn)例。子宮頸癌的5年總生存率約50%，經(jīng)系統(tǒng)治療后仍有75%患者在2年內(nèi)復(fù)發(fā)。惡性腫瘤的復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。近來(lái)，CTC被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一，目前主要用于腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[6-9]。新進(jìn)研究[10]提示，CTC有望作為藥效動(dòng)力學(xué)和預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)志物，為臨床治療決策提供實(shí)質(zhì)性的幫助，并有望在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)快速發(fā)展的今天，成為腫瘤的伴隨診斷標(biāo)志物，從而有效的篩選出最有可能受益的患者。

CTC是進(jìn)入到外周血中的腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，血液中的CTC極為稀少，如何有效捕獲、分離和收集CTC極具挑戰(zhàn)性。在現(xiàn)有的各種CTC技術(shù)中，基于親和性的CTC捕獲分離技術(shù)使用最為廣泛。該技術(shù)利用CD45磁珠抗體吸附白細(xì)胞，在磁場(chǎng)的作用下對(duì)其進(jìn)行去除，可以富集具有全部特征的CTC，包括上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、CK陰性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)特征的CTC。

有研究[11]顯示，在子宮頸上皮內(nèi)瘤變和早期子宮頸浸潤(rùn)癌中，隨著病變程度的加重，基于親和性的免疫磁珠陰性富集的方法CTC的陽(yáng)性率及數(shù)量均增加。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于檢測(cè)CTC在肺癌和乳腺癌中的研究較多，其在評(píng)估子宮頸癌預(yù)后價(jià)值方面也有文獻(xiàn)報(bào)道。Wen等[12]報(bào)道顯示，局部晚期子宮頸癌患者行放療后，CTC陽(yáng)性患者的無(wú)瘤生存期較短、預(yù)后差，進(jìn)一步分析提示CTC是子宮頸癌患者2年無(wú)瘤生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。本實(shí)驗(yàn)同樣基于親和性的免疫磁珠陰性富集檢測(cè)方法，結(jié)果顯示子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移患者的CTC陽(yáng)性率明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移者，提示CTC檢測(cè)技術(shù)可以有效預(yù)測(cè)子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTC在判斷子宮頸轉(zhuǎn)移癌中具有較高的敏感性和特異性，與金標(biāo)準(zhǔn)具有較高的一致性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，CTC與淋巴結(jié)侵犯、淋巴脈管侵犯和FIGO分期明顯相關(guān)，而與患者年齡、是否絕經(jīng)及組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，提示CTC水平與腫瘤惡性程度相關(guān)，與Wen等[12]研究結(jié)果一致。但Wen等的報(bào)道中CTC與FIGO分期無(wú)相關(guān)性，與本研究不一致，可能與Wen等收集病例均為晚期子宮頸癌患者有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)組中5例死亡患者的CTC檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，提示CTC檢測(cè)可以作為評(píng)估子宮頸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)后指標(biāo)。

綜上，CTC檢測(cè)技術(shù)在評(píng)估子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移中具有較高的敏感性和特異性，且CTC水平與淋巴結(jié)侵犯、淋巴脈管侵犯和FIGO分期相關(guān)，可以反映子宮頸癌的惡性程度，可作為預(yù)測(cè)子宮頸癌復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一。CTC檢測(cè)技術(shù)作為液體活檢的重要組成部分，具有微創(chuàng)性甚至無(wú)創(chuàng)性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)報(bào)告周期短等優(yōu)勢(shì)，具有可普及性。