胡 贏，韋成江，龔 晗，賴 浩，趙 偉,2，馮 雁，林 源

“牛眼征”是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶獨有的影像學(xué)特征，表現(xiàn)為增強(qiáng)CT門脈期腫瘤邊緣環(huán)形強(qiáng)化而中心區(qū)低密度，而原發(fā)性肝癌少有這一特征[1-2]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為影像學(xué)“牛眼征”的出現(xiàn)與其供血方式有關(guān)[3-4]。也有研究顯示，腫瘤病灶向正常組織過渡時其血流動力學(xué)發(fā)生明顯改變[5]。目前評價腫瘤血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”是微血管密度(microvessel density, MVD)[6]，是評估多種腫瘤預(yù)后不良的指標(biāo)，如肺腺癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]及結(jié)直腸癌[9]。肝轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)性肝癌的微血管分布和組織密度差異尚未有明確研究。因此，本實驗分析肝轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)性肝癌中膠原纖維及CD31陽性微血管密度(CD31 positive microvessel density, CD31-MVD)的分布差異，探討影像學(xué)“牛眼征”形成的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例收集收集2013年1月～2019年11月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的32例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者及32例原發(fā)性肝癌患者的腹部增強(qiáng)CT資料，同時收集患者手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本蠟塊和臨床病理信息。

1.2 試劑兔抗人多克隆抗體CD31(ab28364)購自美國Abcam公司；即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2檢測試劑盒(KIT-5920)、DAB顯色液及免疫組化抗原修復(fù)緩沖液(EDTA法)(MVS-0098)購自福州邁新公司；Sirius Red天狼猩紅(S8060-5)購自北京索萊寶公司；蘇木精(71020784)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.3 天狼星紅染色組織蠟塊3 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烘烤6 h，二甲苯脫蠟，無水乙醇梯度水化，去離子水洗去殘留的乙醇及其他物質(zhì)，室溫風(fēng)干。天狼星紅染色液A 4 ℃孵育過夜，次日室溫復(fù)溫30 min，去離子水洗去多余的染液，天狼星紅染色液B細(xì)胞核染色30 s，流動水沖洗5 min，蘇木精浸泡1 min，流動水沖洗。1%鹽酸乙醇分化3 s，去離子水沖洗后浸入PBS反藍(lán)，PBS沖洗，梯度無水乙醇脫水，二甲苯透明，晾干后封固。采用FAXtissue系統(tǒng)采集全景高清圖像。

1.4 免疫組化按上述方法烘烤、脫蠟、水化，去離子水洗去殘留乙醇，用EDTA法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性抗體，PBS沖洗，滴加一抗兔抗人CD31多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，次日室溫復(fù)溫30 min。根據(jù)即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2檢測試劑盒進(jìn)行二抗孵育及DAB顯色。蘇木精浸泡30 s，后續(xù)步驟同天狼星紅染色。

1.5 結(jié)果判讀天狼星紅染色：使用EVOS FL成像系統(tǒng)掃描成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)對天狼星紅染色切片進(jìn)行掃描(4倍鏡)。使用Image J軟件計算不同組織切片腫瘤區(qū)和邊緣區(qū)的平均光密度值(AOD值)，由兩名醫(yī)師獨立判讀，最終結(jié)果取兩人平均值。

CD31-MVD：參照Weidner校正方法，任何被抗體染色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管是否形成管腔，只要與周圍微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織有清楚的界限，均判讀為一個可計數(shù)的微血管。由兩位病理科醫(yī)師于10×40倍鏡下在腫瘤邊緣區(qū)、腫瘤區(qū)各取3個視野，取其平均值為MVD值。

1.6 影像學(xué)資料使用開源軟件Syngo-FastView(https://www.siemens-healthineers.com/en-us/medical-imaging-it/syngo-special-topics/syngo-fastview)提取CT圖像(CT檢查使用Siemens Somatom Sensation 64層螺旋CT機(jī))。腫瘤區(qū)影像出現(xiàn)邊緣部分或完全強(qiáng)化，中心不強(qiáng)化或低密度則記為(+)，其他表現(xiàn)記為(-)。由兩名影像專業(yè)中級以上職稱醫(yī)師閱片，按照定義標(biāo)準(zhǔn)對所有病例的影像資料進(jìn)行判定并統(tǒng)計，兩人結(jié)果一致時取該結(jié)果，結(jié)果不一致時由第三名中級以上職稱醫(yī)師進(jìn)行最后判定。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征32例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中，男性26例，女性6例；平均年齡(63.0±4.3)歲；病變位于結(jié)腸20例，直腸12例，原發(fā)灶直徑(6.3±2.2)cm；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；有脈管內(nèi)癌栓10例，無脈管內(nèi)癌栓22例；肝轉(zhuǎn)移灶單發(fā)16例，多發(fā)16例；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶最大徑(3.1±0.8)cm；術(shù)前CEA濃度(6.9±0.6)ng/mL。32例原發(fā)性肝癌中，男性22例，女性10例；平均年齡(57.0±3.8)歲；腫瘤直徑(4.7±1.2)cm；有脈管內(nèi)癌栓12例，無脈管內(nèi)癌栓20例；術(shù)前AFP濃度(533±43.8)μg/mL。

2.2 影像學(xué)“牛眼征”陽性率比較“牛眼征”主要見于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，在原發(fā)性肝癌中較少出現(xiàn)，兩組患者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1，表1)。

圖1 CT示：A.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者“牛眼征”陽性；B.原發(fā)性肝癌患者“牛眼征”陰性

表1 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、原發(fā)性肝癌影像學(xué)“牛眼征”對比分析[n(%)]

2.3 膠原纖維在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與原發(fā)性肝癌邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)的分布差異天狼星紅染色結(jié)果顯示：原發(fā)性肝癌腫瘤邊緣區(qū)較腫瘤區(qū)的膠原纖維分布更密集(圖2A、B)，而結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移兩個區(qū)域的膠原纖維分布較為接近(圖2C、D)。通過對天狼星紅顯色強(qiáng)度(AOD值)進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌邊緣區(qū)染色強(qiáng)度高于腫瘤區(qū)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移邊緣區(qū)的染色強(qiáng)度稍高于腫瘤區(qū)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組間比較結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤區(qū)染色強(qiáng)于原發(fā)性肝癌腫瘤區(qū)染色，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但在邊緣區(qū)兩者染色強(qiáng)度相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、原發(fā)性肝癌邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)天狼星紅染色AOD值對比分析

圖2 原發(fā)性肝癌、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶天狼星紅染色：A.肝癌原發(fā)灶邊緣區(qū)；B.肝癌原發(fā)灶腫瘤區(qū)；C.肝轉(zhuǎn)移瘤邊緣區(qū)；D.肝轉(zhuǎn)移瘤腫瘤區(qū)

2.4 CD31-MVD在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與原發(fā)性肝癌中邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)的分布差異通過對不同區(qū)域的CD31-MVD進(jìn)行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者邊緣區(qū)的CD31-MVD高于腫瘤區(qū)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；原發(fā)性肝癌組邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)的CD31-MVD相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組間比較結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組邊緣區(qū)和腫瘤區(qū)的CD31-MVD均較原發(fā)性肝癌組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3，圖3)。

表3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、原發(fā)性肝癌邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)CD31-MVD統(tǒng)計分析

圖3 原發(fā)性肝癌及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移邊緣區(qū)、腫瘤區(qū)CD31染色，MaxVision法：A.肝癌原發(fā)灶邊緣區(qū)；B.肝癌原發(fā)灶腫瘤區(qū)；C.肝轉(zhuǎn)移瘤邊緣區(qū)；D.肝轉(zhuǎn)移瘤腫瘤區(qū)

3 討論

原發(fā)性肝癌和肝轉(zhuǎn)移瘤這兩種惡性腫瘤幾乎囊括了絕大部分常見的肝臟惡性腫瘤。兩者在影像學(xué)特征上具有非常明顯的差別[10]。本實驗比較了兩者影像學(xué)特征的不同，與其膠原纖維和CD31-MVD之間的關(guān)系。

膠原纖維是結(jié)締組織中分布最廣、含量最多的一種纖維，且腫瘤的硬度、包膜均與結(jié)締組織有關(guān)，在肝臟慢性疾病中如肝硬化、肝惡性腫瘤中均可出現(xiàn)膠原纖維等構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)所形成的纖維化[11-13]。本文作者首先考慮是否是組織密度差異造成了血流速度差異，繼而導(dǎo)致顯影劑滯留造成了“牛眼征”。通過天狼星紅染色標(biāo)記膠原纖維的分布發(fā)現(xiàn)，無論是在原發(fā)性肝癌或結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移外周均包繞著密集分布的膠原纖維帶，且半定量分析結(jié)果顯示兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移邊緣區(qū)與腫瘤中間區(qū)的膠原纖維均有較強(qiáng)表達(dá)。根據(jù)膠原纖維定量分析和影像學(xué)表現(xiàn)，作者推測腫瘤中的膠原纖維含量和分布可能并不能引起其影像學(xué)的特征性表現(xiàn)。

血供的差異亦是影像學(xué)“牛眼征”的形成原因。本實驗采用免疫組化法對微血管標(biāo)志物CD31進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤邊緣區(qū)微血管分布多于腫瘤其他區(qū)域，原發(fā)性肝癌中微血管在邊緣區(qū)及腫瘤其他區(qū)域的分布基本一致。作者推測微血管的這種分布差異是否影響了血流分布范圍，導(dǎo)致造影劑聚集在血流豐富區(qū)從而在CT影像上表現(xiàn)為強(qiáng)化帶，或其影響血流速度造成造影劑分布的時差性，使得不同時期腫瘤組織與正常組織、腫瘤周邊與腫瘤中心區(qū)域出現(xiàn)不同血流比例和造影劑比例，從而在CT影像上表現(xiàn)為不同的強(qiáng)化程度，形成“牛眼征”。而原發(fā)性肝癌邊緣區(qū)與腫瘤區(qū)微血管密度的一致性及其供血主要來源于小動脈，使其在CT影像上表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”的影像學(xué)特點。

綜上所述，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤影像學(xué)的特征性表現(xiàn)可能與腫瘤周圍的膠原纖維分布無直接聯(lián)系；微血管在腫瘤邊緣區(qū)、腫瘤區(qū)的差異性分布可能是引起結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、原發(fā)性肝癌的影像學(xué)特征性表現(xiàn)差異的原因之一，并且在一定程度上為現(xiàn)有的觀點提供了理論依據(jù)。本實驗影像學(xué)特征與病理微形態(tài)學(xué)改變的對比研究給了我們許多新的啟發(fā)，但關(guān)于結(jié)直腸癌的病理微形態(tài)學(xué)與其臨床現(xiàn)象和規(guī)律之間的關(guān)系，還有待我們進(jìn)一步深入研究。