劉 蕾，張學(xué)東，董新茜，范 雪，朱曉云，張 銘，任玉波

WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分冊(cè)[1]中明確了胃底腺型胃腫瘤局限黏膜內(nèi)的為泌酸腺腺瘤，有黏膜下浸潤(rùn)時(shí)為胃底腺型腺癌。組織學(xué)分為：主細(xì)胞為主、壁細(xì)胞為主和混合型，大多數(shù)為主細(xì)胞為主型。胃底腺型胃腫瘤較傳統(tǒng)胃腺癌有其獨(dú)特的病理特征，但目前對(duì)其分子水平方面的認(rèn)識(shí)尚不足。本文對(duì)北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院和聊城市人民醫(yī)院共11例胃底腺型胃腫瘤標(biāo)本進(jìn)行分子檢測(cè)，并復(fù)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)，以期提高對(duì)其發(fā)生發(fā)展過程中驅(qū)動(dòng)因素的認(rèn)識(shí)，可能有助于確定臨床相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床及組織病理學(xué)資料收集2015年1月～2021年3月北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院和聊城市人民醫(yī)院胃鏡下切除標(biāo)本，經(jīng)2～3名專科高年資醫(yī)師復(fù)診及免疫組化輔助確診為泌酸腺腺瘤1例、胃底腺型腺癌10例。其中男性5例，女性6例，年齡46～75歲，平均63歲。11例均為主細(xì)胞為主型，輕～中度異型，未見脈管、神經(jīng)侵犯，無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。免疫表型：瘤細(xì)胞胃蛋白酶原Ⅰ、MUC6均彌漫陽(yáng)性，MUC5ac個(gè)別或小灶陽(yáng)性，H+/K+-ATPase陰性或少數(shù)陽(yáng)性，MUC2、CD10均陰性，β-catenin均膜陽(yáng)性，p53陰性或部分弱陽(yáng)性。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)取材，石蠟包埋，4 μm厚切片，采用原位雜交方法檢測(cè)EB病毒核酸EBER，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，并以鼻咽非角化性癌作為陽(yáng)性對(duì)照。

腫瘤組織蠟塊切卷，采用北京吉因加醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)公司高通量DNA panel測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序(next generation sequencing, NGS)，一次性獲得GNAS、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、APC、CTNNB1、HER-2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等基因的變異信息，包括點(diǎn)突變、插入、缺失、融合、擴(kuò)增，并以瘤周正常組織作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 原位雜交EBER檢測(cè)結(jié)果11例胃底腺型胃腫瘤EBER均呈陰性。

2.2 NGS結(jié)果10例胃底腺型腺癌中：6例GNAS和2例KRAS錯(cuò)義突變，其中2例同時(shí)發(fā)生GNAS、KRAS錯(cuò)義突變(圖1)；2例FGFR錯(cuò)義突變，1例TP53錯(cuò)義突變，1例BRCA1錯(cuò)義突變；1例APC、KRAS、NRAS、FGFR同義突變，1例MSH6、BRCA1同義突變；1例CDK4擴(kuò)增，但拷貝數(shù)僅1.4，予以忽略。1例泌酸腺腺瘤未見GNAS、KRAS、TP53突變。11例均未檢出融合基因，且CTNNB1、BRAF、PIK3CA、HER-2、MLH1、MSH2、PMS2基因均未檢出變異(表1)。

表1 11例胃底腺型胃腫瘤基因變異及臨床病理資料

圖1 A.GNAS基因錯(cuò)義突變：(例11)c.601C>T，p.R201C；B.KRAS基因錯(cuò)義突變：(例11)c.40G>A，p.V14I

3 討論

胃底腺型胃腫瘤有關(guān)的分子水平數(shù)據(jù)有限。目前文獻(xiàn)已報(bào)道泌酸腺腺瘤和胃底腺型腺癌200余例，其中約半數(shù)病例進(jìn)行了基因水平檢測(cè)及探討，以Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因及GNAS、KRAS突變研究最多。

β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，正常情況下，其胞質(zhì)水平通過降解途徑保持在較低水平，當(dāng)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因如CTNNB1、AXIN、APC、PPP2R1A突變或甲基化被激活時(shí)，可導(dǎo)致β-catenin過度積累和核轉(zhuǎn)移，繼而激活下游基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此通路在胃癌中受廣泛關(guān)注，并探索該通路不同分子成分的靶向治療[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)胃底腺型胃腫瘤中Wnt/β-catenin通路基因突變率較高且具有異質(zhì)性。既往研究[3-4]顯示：胃底腺型腺癌中β-catenin核陽(yáng)性率約85%，Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因突變率約45%，且β-catenin核表達(dá)指數(shù)、高表達(dá)的例數(shù)及相關(guān)基因突變率均高于傳統(tǒng)胃腺癌[4]。然而，本組10例胃底腺型腺癌均未檢出β-catenin核表達(dá)及相關(guān)基因突變，其它我國(guó)的病例報(bào)告中亦未發(fā)現(xiàn)[5]，可能限于研究病例數(shù)量較少、腫瘤浸潤(rùn)深度較淺，或其它可能機(jī)制待進(jìn)一步探討。

Lee等[6]研究泌酸腺腺瘤發(fā)現(xiàn)，β-catenin蛋白核表達(dá)指數(shù)和相關(guān)基因突變低于胃底腺型腺癌，約27%β-catenin核陽(yáng)性，約36%發(fā)生APC、AXIN或PPP2R1A基因突變。這些遺傳學(xué)改變和β-catenin核染色對(duì)泌酸腺腺瘤臨床病理特征的影響并未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，但有研究表明黏膜下受累的過程中可能需要通過β-catenin核轉(zhuǎn)變激活Wnt/β-catenin信號(hào)[4,6]。本組1例泌酸腺腺瘤未檢出β-catenin核表達(dá)及相關(guān)基因突變。

Murakami等[7]分析Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)基因(包括sfrp、APC和AXIN2)的甲基化可能與胃底腺型胃腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，高甲基化在胃底腺型腺癌中比泌酸腺腺瘤更常見。本研究未涉及基因甲基化檢測(cè)。

多個(gè)研究組[3,8-11]對(duì)胃底腺型腺癌和泌酸腺腺瘤中GNAS、KRAS突變進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)匯總既往文獻(xiàn)及本組病例(表2)，胃底腺型腺癌中GNAS和KRAS的錯(cuò)義突變率分別約24.0%(25/104)、7.7%(7/91)，泌酸腺腺瘤中GNAS和KRAS的錯(cuò)義突變率分別約18.2%(2/11)、0(0/5)。幾乎所有病例的GNAS突變都發(fā)生在堿基第601或602位、氨基酸第201位，僅1例GNAS突變于堿基第680位、氨基酸第227位。

表2 文獻(xiàn)報(bào)道胃底腺型胃腫瘤GNAS和KRAS基因突變情況

可見胃底腺型腺癌和泌酸腺腺瘤GNAS的錯(cuò)義突變檢出率均比KRAS高。而在傳統(tǒng)胃腺癌中GNAS突變不存在或罕見，KRAS突變比較常見，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度相關(guān)。既往GNAS和KRAS突變?cè)谖傅紫傩臀改[瘤和傳統(tǒng)胃腺癌可同時(shí)發(fā)生[3,12]。本組也有2例胃底腺型腺癌同時(shí)發(fā)生GNAS、KRAS錯(cuò)義突變。

Nomura等[3]和Kushima等[9]進(jìn)一步評(píng)估了胃底腺型腺癌臨床病理特征與GNAS突變的關(guān)系，有GNAS突變腫瘤樣本較無突變腫瘤樣本更易侵入黏膜下層及腫瘤大小增加，但這些侵入能力和腫瘤大小的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述發(fā)現(xiàn)提示：GNAS突變可能在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和侵襲中起作用。本組GNAS突變檢出率60%(6/10)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤大小之間評(píng)估并未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)性，對(duì)胃底腺型胃腫瘤預(yù)后指導(dǎo)意義有待后續(xù)累積更多病例探討。Nomura等[3]在一組胃底腺型腺癌中發(fā)現(xiàn)了2例KRAS突變，分別是伴淋巴管浸潤(rùn)的最大腫瘤和黏膜下浸潤(rùn)最深的腫瘤，而本組中的2例KRAS突變也是發(fā)生在黏膜下浸潤(rùn)最深病例。這些觀察提示KRAS突變可能與胃底腺型腺癌的侵襲性有關(guān)，但由于樣本量小尚不能得出結(jié)論性結(jié)果。

腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)中有學(xué)者曾對(duì)295例原發(fā)性胃癌樣本進(jìn)行分子鑒定[13]，提出將胃癌分為4種分子亞型：EBV陽(yáng)性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、基因組穩(wěn)定性型和染色體不穩(wěn)定型。此分類擴(kuò)展了對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的理解，為胃癌患者分層、靶向治療、臨床試驗(yàn)提供篩選依據(jù)，但各亞型特點(diǎn)尚不能準(zhǔn)確反映胃底腺型胃腫瘤的分子遺傳學(xué)特征。EBV陽(yáng)性型好發(fā)于胃底或胃體，多有PIK3CA基因突變，EBER是最豐富的EB病毒轉(zhuǎn)錄物，病毒長(zhǎng)期處于潛伏感染狀態(tài)，通過多種信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)等作用[14]。胃底腺型胃腫瘤雖然也好發(fā)胃底體部，但本組11例EBER原位雜交均陰性，既往文獻(xiàn)亦無EB病毒在此類型腫瘤中的報(bào)道。微衛(wèi)星不穩(wěn)定型好發(fā)于胃竇或幽門，由于DNA修復(fù)機(jī)制異常而導(dǎo)致DNA高突變率，如PIK3CA、HER-2等[15]。Ueyama等[11]在34例胃底腺型胃腫瘤的測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)2例PIK3CA錯(cuò)義突變。本組PIK3CA及錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均未檢出非同義突變，既往文獻(xiàn)亦無此類型腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定的報(bào)道。

HER-2過表達(dá)在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化中起作用。Meta分析顯示，在胃癌患者中HER-2過表達(dá)與預(yù)后差有關(guān)[16]。既往僅有3例壁細(xì)胞型胃腺癌免疫組化或原位雜交檢測(cè)HER-2均陰性[17-18]。本組11例均未檢出HER-2突變，是否與早期胃癌及長(zhǎng)期預(yù)后良好相關(guān)，尚需要更多數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡明。

編碼p53蛋白的TP53基因在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡中起關(guān)鍵作用，TP53基因突變和p53蛋白過表達(dá)是預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后重要的生物標(biāo)志物。目前報(bào)道的胃底腺型胃腫瘤中大多p53無過表達(dá)[19-20]。本組首次發(fā)現(xiàn)1例胃底腺型腺癌TP53錯(cuò)義突變，而蛋白水平均陰性或少數(shù)弱陽(yáng)性。與傳統(tǒng)胃腺癌相比，胃底腺型胃腫瘤p53過表達(dá)發(fā)生率極低[11]。

另外，Ke等[21]認(rèn)為Sonic Hedgehog(Shh)信號(hào)通路可能獨(dú)立于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，參與胃底腺型腺癌的進(jìn)展并影響預(yù)后。本研究首次報(bào)道了胃底腺型胃腫瘤可發(fā)生FGFR、BRCA1等基因突變，Ueyama等[11]還發(fā)現(xiàn)1例CDNK2A錯(cuò)義突變，這些遺傳學(xué)的多樣性與胃底腺型胃腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚有待探討。

本研究未發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因非同義突變；胃底腺型腺癌GNAS錯(cuò)義突變率較高，KRAS、TP53突變較少見；尚無EB病毒相關(guān)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定及HER-2突變的報(bào)道。本研究病例數(shù)有限，需要繼續(xù)累積病例來充分闡明胃底腺型胃腫瘤發(fā)生機(jī)制、遺傳學(xué)改變及與臨床病理特征的關(guān)系。