王德望，夏 群，戚庭月，王成海,,4

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，其主要病理類型是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)[2]?；蛲蛔兒铜h(huán)境因素在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3-4]。目前，甲狀腺癌的發(fā)病機制尚不清楚。環(huán)狀核糖核酸(circular ribonucleic acid, circ-RNA)是一類非編碼RNA，其參與多種腫瘤的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[5-7]。本實驗利用NCBI在線數(shù)據(jù)集(GSE93522)分析得到PTC差異表達的circ-RNAs，其中circ-101555表達升高，本實驗旨在探討circ-101555對甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集2018年10月～2020年10月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院行甲乳外科手術(shù)的79例新鮮PTC組織和鄰近正常甲狀腺組織，患者年齡36～79歲，中位年齡58歲；男性30例，女性49例。所有患者手術(shù)前均未行放、化療。標本使用及臨床資料收集均經(jīng)揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。新鮮標本采集后立即放入液氮罐里，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，已備后期實驗使用。

1.2 材料與細胞正常甲狀腺濾泡上皮細胞PTFE和CM-H023培養(yǎng)基，購于武漢Procell公司。PTC細胞株B-CPAP和BHT101購于上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫。PTFE在CM-H023培養(yǎng)基中培養(yǎng)，PTC細胞株在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并添加青霉素G(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和10%胎牛血清。所有細胞系均在37 ℃、5%CO2的增濕空氣中培養(yǎng)。MMP-9抗體購自武漢博士德生物公司；Wnt1抗體購自美國Abcam公司。Circ-101555過表達和敲低質(zhì)粒由上海生工生物公司合成。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 qRT-PCR檢測總RNA提取試劑盒分離腫瘤組織或細胞后，用cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，再用2×Taq PCR MasterMix進行qRT-PCR。詳細步驟按試劑說明書進行。

1.4 RNA原位分子雜交實驗Circ-101555 RNA探針和原位雜交試劑盒購于武漢BOSTER生物公司。實驗步驟按試劑說明書進行雜交結(jié)果判定標準：細胞中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為circ-101555陽性細胞；光鏡下隨機選擇5個高倍視野，計算陽性細胞與總細胞數(shù)的百分率，<1%為陰性，1%～100%為陽性。實驗設(shè)陽性對照，不加探針的染色組織為空白對照。

1.5 MTT檢測細胞增殖活性將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的腫瘤細胞，按4×104/mL的密度接種到96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，在每孔內(nèi)添加10 μL MTT溶液，繼續(xù)溫箱孵育2 h。吸棄孔中液體后添加150 μL二甲基亞砜，孵育10 min，立即用酶標儀測定每孔在450 nm處的OD值，以O(shè)D值表示細胞增殖活性。

1.6 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力(1)細胞遷移實驗：腫瘤細胞用無血清細胞培養(yǎng)液制備成單細胞懸浮液。每個檢測樣品吸取0.2 mL至Transwell小室上室內(nèi)，下室內(nèi)添加有血清的培養(yǎng)液0.6 mL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。將小室取出，棉簽擦掉基質(zhì)膠及沒穿膜的細胞，用PBS洗滌，95%乙醇固定15 min，結(jié)晶紫染色。隨機選擇5個光鏡視野，統(tǒng)計細胞遷移數(shù)量。(2)細胞侵襲實驗：腫瘤細胞用無血清細胞培養(yǎng)液制備成單細胞懸浮液。把Matrigel放在4 ℃冰箱過夜融化，吸取50 μg Matrigel添加到95 μL無血清細胞培養(yǎng)液內(nèi)，將稀釋后的Matrigel添加到Transwell小室內(nèi)，轉(zhuǎn)移到37 ℃孵育1 h。后續(xù)實驗過程和細胞遷移實驗相同。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測circ-101555的下游靶基因及驗證Circ-101555和miR-1178的下游靶基因預(yù)測網(wǎng)站分別為circinteractome.nia.nih.gov、www.targetscan.org和mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php，miR-1178下游靶基因的有效驗證通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐?/p>

1.8 Western blot法檢測蛋白表達腫瘤細胞培養(yǎng)24 h，分別在細胞中加入含1%PMSF的RIPA溶液，置于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，以4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清，測定蛋白濃度并標記、分裝。SDS-PAGE凝膠電泳采用10%分離膠、5%濃縮膠。把2×Loading Buffer添加到蛋白溶液中，100 ℃孵化5 min。每個上樣孔中均加入30 μg蛋白樣品，70 V電泳，觀察染料到達分離膠時，調(diào)整電壓為100 V繼續(xù)電泳，觀察溴酚藍到達凝膠下端時，終止電泳。把凝膠取出，裁剪合適大小的NC膜，放在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡備用。設(shè)置200 mA恒流、冰上轉(zhuǎn)膜50 min。把NC膜置于5%牛血清白蛋白內(nèi)，于室溫下孵育2 h。將一抗溶液(1∶1 000)放入NC膜，4 ℃冰箱孵化過夜。次日將二抗(1∶4 000)浸泡NC膜，37 ℃孵育2 h，按照ECL方法顯色。將GAPDH設(shè)置為參照，分析條帶的灰度值，以灰度值計算蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織中circ-101555的表達RNA原位雜交實驗結(jié)果表明：79例PTC組織中circ-101555 RNA主要定位于細胞質(zhì)中，染色為大小不等、著色深淺不一的棕黃色顆粒或團塊呈陽性(圖1A)；其在癌旁正常甲狀腺組織中未出現(xiàn)棕黃色顆粒，呈陰性(圖1B)。PTC組織中circ-101555的陽性比值為0.758±0.116，明顯高于癌旁正常組織(0.072±0.012)，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.862，P<0.05)。

圖1 RNA原位雜交檢測circ-101555 RNA的表達：A.PTC組織中circ-101555 RNA呈陽性，細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒；B.癌旁正常甲狀腺組織中呈陰性，細胞中未出現(xiàn)棕黃色顆粒

2.2 PTC中circ-101555表達與臨床病理特征的關(guān)系在79例PTC組織中，根據(jù)陽性細胞百分率分為circ-101555陽性組(1%～100%)和circ-101555陰性組(<1%)。circ-101555表達與腫瘤局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、合并其他良性甲狀腺疾病均密切相關(guān)(P均<0.05)，而與患者年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤大小、TNM分期和鈣化均無相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

表1 PTC組織中circ-101555表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Circ-101555對甲狀腺癌細胞增殖活性的影響與對照組相比，過表達circ-101555及敲低circ-101555組甲狀腺癌細胞的增殖活性變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。這提示circ-101555對甲狀腺癌細胞的生長和增殖無明顯影響。

表2 circ-101555對甲狀腺癌細胞增殖活性影響

2.4 Circ-101555對甲狀腺癌細胞遷移和侵襲的影響Transwell實驗結(jié)果表明：與對照組相比[(58.6±6.46)個]，過表達circ-101555甲狀腺癌細胞的侵襲數(shù)目增多[(93.6±9.28)個]，而敲低circ-101555甲狀腺癌細胞的侵襲數(shù)目明顯減少[(26.82±5.44)個]。與對照組相比[(50.95±7.21)個]，過表達circ-101555甲狀腺癌細胞的遷移數(shù)目增多[(81.6±9.98)個]，敲低circ-101555甲狀腺癌細胞的遷移數(shù)目明顯減少[(23.86±6.42)個]。兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 Circ-101555對甲狀腺癌細胞遷移和侵襲的影響

2.5 Circ-101555下游靶基因的預(yù)測及驗證預(yù)測circ-101555的下游miRNA包括miR-324、miR-1178、miR-1182和miR-1208，根據(jù)結(jié)合位點數(shù)目>7個且context+score percentile>95分，僅miR-1178符合上述條件。同時調(diào)整circ-101555表達后miR-1178表達也隨之變化(圖3)，提示miR-1178是circ-101555的下游靶基因。對miR-1178的編碼RNA預(yù)測得到Wnt1的3′UTR有miR-1178種子序列的結(jié)合位點。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥贸鲈赪nt1 3′UTR野生型轉(zhuǎn)染組，miR-1178高表達可明顯抑制相應(yīng)的熒光活性，而在突變組miR-1178中未有這種抑制作用(圖4)。因此miR-1178與Wnt1的結(jié)合具有特異性，Wnt1是miR-1178的直接靶基因。

圖3 Circ-101555對miR-1178表達的影響：過表達circ-101555后miR-1178表達水平下降，敲低circ-101555后miR-1178的表達水平升高；*P<0.05

圖4 A.Wnt1 3′UTR(455～449位)與miR-1178種子序列(1～7位)有直接的結(jié)合位點；B.雙熒光素酶報告質(zhì)粒與野生型或突變型Wnt1 3′UTR的關(guān)系圖；C.野生型或突變型Wnt1 3′UTR質(zhì)粒與miR-1178共轉(zhuǎn)染后B-CPAP細胞熒光素酶的相對活性：在Wnt1 3′UTR野生型(wt Wnt1)轉(zhuǎn)染組，miR-1178高表達可明顯抑制相應(yīng)的熒光活性，而在突變組(mut Wnt1)miR-1178未有這種抑制作用，NC為對照組，*P<0.05

2.6 Circ-101555對甲狀腺癌細胞中Wnt信號通路和侵襲遷移的影響回復(fù)實驗結(jié)果表明：改變circ-101555和miR-1178表達對PTC細胞侵襲、遷移的影響以及Wnt信號通路中Wnt1、β-catenin和MMP-9蛋白的變化，結(jié)果顯示circ-101555能促進甲狀腺癌細胞的Wnt信號通路，促進甲狀腺癌細胞的侵襲、遷移(表3，圖5、6)。

圖5 Transwell實驗顯示circ-101555調(diào)控miR-1178促進甲狀腺癌細胞侵襲、遷移：NC.對照組；1.circ-101555過表達組；2.circ-101555敲低組；3.circ-101555+miR-1178過表達組；4.circ-101555+miR-1178敲低組；5.circ-101555過表達+miR-1178敲低組；6.circ-101555敲低+miR-1178過表達組

表3 甲狀腺癌細胞侵襲和遷移數(shù)目、Wnt1、β-catenin和MMP-9蛋白水平

3 討論

甲狀腺癌起源于甲狀腺濾泡上皮細胞或甲狀腺濾泡旁細胞。近年甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，而病死率較為穩(wěn)定[8]。甲狀腺癌組織學(xué)類型有5種，其中80%的類型是PTC[4]。甲狀腺癌以手術(shù)治療為主，其次輔助放射性碘治療[9]。轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和放射性碘治療無效，往往是甲狀腺癌患者死亡的主要原因[3]。目前，甲狀腺癌的發(fā)病機制尚不清楚，深入研究甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，有助于提高患者的預(yù)后。

在PTC研究中circRNA被廣泛用作miRNA海綿來調(diào)節(jié)下游的靶基因，影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。例如，circ-58124作為一個新的致癌基因與PTC患者惡性特征及預(yù)后不良有關(guān)，其抑制NOTCH3/GATAD2A信號軸促進PTC細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。Circ-102002在PTC組織和細胞中表達上調(diào)，海綿miR-488-3p促進HAS2過表達可以恢復(fù)受抑制的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換和遷移[13]。Circ-HIPK3通過吸附miR-338-3p，上調(diào)其靶基因RAB23的表達，從而促進甲狀腺癌的發(fā)生和侵襲性[14]。敲除circ-0067934可抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[15]。本實驗結(jié)果表明，circ-101555能調(diào)控miR-1178的表達，發(fā)揮其microRNA海綿作用，從而激活Wnt信號通路。

圖6 Western blot實驗顯示circ-101555調(diào)控miR-1178對Wnt信號通路的影響：NC.對照組；1.circ-101555過表達組；2.circ-101555敲低組；3.circ-101555+miR-1178過表達組；4.circ-101555+miR-1178敲低組；5.circ-101555過表達+miR-1178敲低組；6.circ-101555敲低組+miR-1178過表達組

Wnt1和β-catenin是Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，當Wnt信號通路被激活，兩者表達水平升高[16]，它們在能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥、細胞增殖等生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。研究表明在腫瘤組織中Wnt信號通路被過度激活，從而對腫瘤細胞的進展發(fā)揮促進作用，比如Wnt信號激活促進胃癌細胞增殖遷移和增加EMT水平，而抑制Wnt信號可降低胃癌細胞生長和轉(zhuǎn)移能力[18]。CircRNA-102171在PTC中表達上調(diào)，其與CTNNBIP1相互作用，阻斷它與β-catenin/TCF3/TCF4/LEF1復(fù)合物的相互作用，導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路的激活，促進PTC細胞的增殖、遷移和侵襲[19]。Circ-ITCH能吸附miR-22-3p上調(diào)CBL的表達，從而抑制Wnt/β-catenin通路的激活，減緩PTC進展[20]。本實驗結(jié)果顯示：circ-101555通過抑制miR-1178表達升高甲狀腺癌細胞中Wnt信號通路Wnt1和β-catenin蛋白水平，從而促進了甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移，提示circ-101555也是Wnt信號通路的激活劑。

腫瘤細胞在轉(zhuǎn)移至新的組織和器官時，能合成大量的細胞外基質(zhì)降解酶，破壞細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為腫瘤的侵襲和遷移提供條件[21]。研究表明Wnt信號通路能調(diào)控MMP-9的表達[22]，MMP-9是常見的細胞外基質(zhì)降解酶，能降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移提供必要的條件[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)circ-101555激活Wnt信號通路中Wnt1和β-catenin的蛋白水平后，MMP-9的含量增加，癌細胞周圍的基質(zhì)降解，增加了基質(zhì)間隙，促進癌細胞的入侵和轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果說明MMP-9會被不同的信號通路激活，從而促進癌細胞侵襲和遷移，本實驗結(jié)果與文獻報道一致。

綜上所述，circ-101555通過下調(diào)miR-1178表達后激活Wnt信號通路中Wnt1、β-catenin和MMP-9的表達水平，從而促進甲狀腺癌細胞的侵襲和遷移，為研究circ-101555抗甲狀腺癌作用機制提供了數(shù)據(jù)，為今后診斷和治療甲狀腺癌提供有力的理論基礎(chǔ)。