張 麗，任彩虹，陳余朋，張 聲，鄭 珂

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其預(yù)后因病理類型及分期不同而不同，其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最為常見(jiàn)。WHO(2017)甲狀腺腫瘤分類將PTC分為惰性及侵襲性，侵襲性亞型包括高細(xì)胞型、柱狀細(xì)胞型、鞋釘型、實(shí)性型以及新近提出的NTRK重排甲狀腺乳頭狀癌(NTRK-rearranged papillary thyroid carcinomas, NRPTC)，侵襲性PTC患者預(yù)后較差[1]。PTC中最常見(jiàn)的基因改變?yōu)锽RAF V600E突變(約70%)，其余分子改變包括RET融合、TERT啟動(dòng)子突變、RAS突變及TP53、PIK3CA、AKT1、NTRK等基因改變[2-4]。有部分文獻(xiàn)報(bào)道NRPTC多與BRAF V600E突變互斥[3,5]，具有浸潤(rùn)性、多結(jié)節(jié)、廣泛淋巴管血管播散、易于淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[6-7]。雖然部分NRPTC表現(xiàn)為侵襲性臨床行為，但NTRK靶向抑制劑拉羅替尼和恩曲替尼已獲得美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，可用于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NRPTC的治療[6]。故加強(qiáng)對(duì)NRPTC的辨識(shí)及篩查具有重要的臨床意義，分子檢測(cè)、pan-TRK免疫組化用于NTRK重排相關(guān)腫瘤的篩查已有文獻(xiàn)報(bào)道。目前關(guān)于NRPTC的報(bào)道有限、臨床及病理醫(yī)師對(duì)NRPTC病理形態(tài)學(xué)特征及臨床生物學(xué)行為認(rèn)識(shí)不足，且用于篩查NRPTC的pan-TRK免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn)僅見(jiàn)零星報(bào)道。本文收集176例PTC行pan-TRK免疫組化染色，后經(jīng)分子檢測(cè)驗(yàn)證得到7例NRPTC，探討其臨床病理學(xué)特征及pan-TRK免疫組化表達(dá)模式，旨在提高臨床與病理醫(yī)師對(duì)其的認(rèn)識(shí)水平，探索可能作為陽(yáng)性篩查的pan-TRK免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019～2021年福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院176例PTC手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)免疫組化Optiview法及熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)后獲得7例NRPTC。7例NRPTC中男性3例，女性4例，發(fā)病年齡22～56歲，平均34.29歲，中位年齡29歲。7例患者均為體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫物，就診時(shí)4例患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分期：T1期2例，T2期2例，T3期2例，T4期1例。5例患者行雙側(cè)甲狀腺切除及雙側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)；2例行單側(cè)甲狀腺切除及單側(cè)頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后行碘131治療，1例轉(zhuǎn)移灶明顯減少甚至消失，1例無(wú)明顯緩解。所有病例均未使用NTRK抑制劑治療(表1)。

1.2 免疫組化所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，分別行HE及免疫組化Optiview法染色。pan-TRK采用Ventana公司Optiview DAB IHC Detection kit和Amplification擴(kuò)增盒，BRAF VE1采用Ventana公司Optiview DAB IHC Detection kit，Ki-67采用Dako公司EnVision FLEX+?？贵wpan-TRK、BRAF VE1購(gòu)自羅氏公司，Ki-67購(gòu)自北京中杉金橋公司。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

在PTC中，pan-TRK陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判讀：無(wú)細(xì)胞染色為陰性；<50%細(xì)胞中等陽(yáng)性或任何比例的細(xì)胞弱陽(yáng)性為1+；≥50%細(xì)胞中等陽(yáng)性或<50%細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性為2+；≥50%細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性為3+[3]。BRAF陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)。Ki-67為細(xì)胞核定位，評(píng)估其陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.3 NTRK和BRAF分子檢測(cè)本組對(duì)pan-TRK免疫組化陽(yáng)性病例行NTRK和BRAF熒光定量PCR檢測(cè)。石蠟組織8～10 μm厚切片4～5張，置于高溫滅菌的1.5 mL EP管中，使用石蠟包埋組織DNA/RNA提取試劑盒。采用熒光定量PCR法，使用NTRK基因融合檢測(cè)試劑盒和BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)NTRK和BRAF基因。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 眼觀7例NRPTC腫瘤最大徑0.8～3.5 cm。切面均呈灰白、灰黃、灰紅色，質(zhì)中或質(zhì)硬，其中6例邊界不清，1例邊界尚清。7例中5例為甲狀腺內(nèi)多發(fā)。

2.2 鏡檢低倍鏡下7例NRPTC均被纖維間隔分隔成多結(jié)節(jié)樣生長(zhǎng)(圖1)。中倍鏡下7例NRPTC均可見(jiàn)大小不一濾泡與實(shí)性混雜生長(zhǎng)，伴或不伴乳頭結(jié)構(gòu)(圖2)。7例中5例以濾泡為主(其中4例伴有小部分乳頭結(jié)構(gòu))，1例以實(shí)性結(jié)構(gòu)為主(圖3)，1例以乳頭結(jié)構(gòu)為主。7例中6例可見(jiàn)腎小球樣結(jié)構(gòu)(圖2)、2例可見(jiàn)乳頭水腫和(或)膠原變性(圖4)。高倍鏡下7例NRPTC腫瘤細(xì)胞質(zhì)均淡染，灶區(qū)可見(jiàn)胞質(zhì)透明細(xì)胞，細(xì)胞核均較“圓”。6例含乳頭結(jié)構(gòu)的病例中均可見(jiàn)乳頭表面細(xì)胞核極性反轉(zhuǎn)，細(xì)胞核遠(yuǎn)離細(xì)胞基底(圖4)。核分裂罕見(jiàn)(<1個(gè)/50 HPF)。

其他改變：7例NRPTC中6例可見(jiàn)砂粒體或營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化，均無(wú)壞死；4例可見(jiàn)脈管內(nèi)癌栓；4例侵犯甲狀腺外組織。7例NRPTC背景甲狀腺4例為淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，1例為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，2例無(wú)明顯異常(表1)。

表1 7例NRPTC的臨床病理特征

2.3 細(xì)針穿刺細(xì)胞病理學(xué)特征本組中有3例行術(shù)前細(xì)針穿刺，鏡下表現(xiàn)為乳頭狀、片狀、散在分布，核毛玻璃樣，可見(jiàn)核溝及核內(nèi)假包涵體，均有淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎背景。

2.4 免疫表型及分子特征免疫組化檢測(cè)pan-TRK結(jié)果顯示：176例PTC中162例陰性、4例1+、3例2+、7例3+(圖5)。應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)pan-TRK免疫組化陽(yáng)性者行NTRK檢測(cè)結(jié)果顯示：pan-TRK 1+、2+、3+者NTRK重排陽(yáng)性比例分別為0/4、1/3、6/7(圖6)。7例NTRK重排陽(yáng)性者pan-TRK 3+者6例、2+者1例，且均為彌漫陽(yáng)性(>50%腫瘤細(xì)胞)。Fisher精確檢驗(yàn)分析NTRK重排和pan-TRK免疫組化評(píng)分一致性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。pan-TRK免疫組化2+～3+預(yù)測(cè)NRPTC的敏感性為70%，NTRK3和NTRK1重排比為6∶1，BRAF V600E均未突變。Ki-67增殖指數(shù)1%～10%。

①②③④⑤圖1 低倍鏡下腫瘤被纖維組織分隔成多結(jié)節(jié)樣 圖2 大小不一濾泡混雜排列及腎小球樣結(jié)構(gòu) 圖3 腫瘤細(xì)胞排列緊密,呈實(shí)性結(jié)構(gòu) 圖4 乳頭軸心水腫、乳頭表面細(xì)胞核極性反轉(zhuǎn) 圖5 免疫組化檢測(cè)pan-TRK呈3+,Optiview法

圖6 熒光定量PCR檢測(cè)NTRK重排呈陽(yáng)性：黑線為樣本，紅線為陽(yáng)性對(duì)照，綠線為陰性對(duì)照

表2 NTRK重排熒光定量PCR與pan-TRK免疫組化染色的一致性比較

2.5 隨訪本組7例NRPTC隨訪7～33個(gè)月，其中2例患者在手術(shù)時(shí)即發(fā)現(xiàn)其存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，術(shù)后行碘131治療；其余5例隨訪7～8個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但其中2例存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后未行碘131治療；均無(wú)死亡病例。

3 討論

NTRK基因家族包括NTRK1、NTRK2、NTRK3，與不同的伙伴基因融合導(dǎo)致TrkA、TrkB、TrkC蛋白表達(dá)上調(diào)[8]，這些蛋白正常表達(dá)于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)以及少部分血管平滑肌。Trk蛋白與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合后活化，導(dǎo)致下游MAPK、Ras-ERK、PIK3、PLCγ、PI3K/AKT信號(hào)通路激活、下游細(xì)胞增殖，對(duì)感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)展、功能及存活等起重要作用[8-9]。NTRK重排多見(jiàn)于實(shí)體腫瘤，如分泌性癌、先天性中胚葉腎瘤、嬰兒型纖維肉瘤、甲狀腺癌(尤其放射相關(guān)性PTC、侵襲性乳頭狀癌)、Spitz樣黑色素瘤、兒童中線膠質(zhì)瘤、KIT/PDGFRA/RAS陰性胃腸道間質(zhì)瘤等[8]。

NRPTC在PTC中的發(fā)病率為2.3%～3.4%[10]，個(gè)別報(bào)道可達(dá)6.7%[9]。NRPTC在成人PTC中約占2.34%，兒童PTC中NRPTC較多見(jiàn)[6,11]，北美兒童NRPTC占兒童PTC的26%[12]。文獻(xiàn)報(bào)道NTRK3融合PTC的發(fā)生率高于NTRK1，為1.4～5倍[3,9,13]。本組7例NRPTC中6例為NTRK3、1例為NTRK1，與文獻(xiàn)報(bào)道相似。目前，甲狀腺癌中NTRK1融合伙伴基因有TPM3、TPR、IRF2BP2、TFG、SSBP2、SQSTM1、TRIM33和PPL，NTRK3融合伙伴基因有ETV6、EML4、SQSTM1、RBPMS、VIM和ERC1，其中ETV6-NTRK3融合最常見(jiàn)[3-4,6,9-10,14-15]。

NRPTC發(fā)病年齡較廣，年齡6～77歲，平均(32.8±16.0)歲，男女比為1∶3.5。腫瘤多為T3期，小部分T2期。臨床常表現(xiàn)為頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為50%～100%，以側(cè)方淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多見(jiàn)。常見(jiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為6.8%～50%，以肺轉(zhuǎn)移多見(jiàn)，其次腦轉(zhuǎn)移[6-7,9,16]。本組病例女性稍多見(jiàn)，男女比為3∶4，發(fā)病年齡22～56歲，平均34.29歲，4例患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2例患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。本組T1、T2、T3期各2例，T4期1例，且所有病例均為體檢發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)患者高臨床分期不同，可能與患者自我體檢意識(shí)及診斷技術(shù)提升有關(guān)。

文獻(xiàn)報(bào)道NRPTC腫瘤最大徑0.5～5.9 cm，多呈浸潤(rùn)性、多結(jié)節(jié)生長(zhǎng)方式，伴甲狀腺內(nèi)外廣泛的淋巴管血管播散，罕見(jiàn)核分裂象[6-7]；組織形態(tài)學(xué)可以為濾泡亞型、經(jīng)典型及實(shí)性型[3,10]，且常為濾泡亞型[9]。腫瘤常見(jiàn)局灶或彌漫的透明細(xì)胞[10]，大部分病例背景甲狀腺表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，部分為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫[7,9]。文獻(xiàn)報(bào)道NTRK1融合型PTC多為混合性乳頭和濾泡結(jié)構(gòu)，而NTRK3融合型PTC大多以濾泡結(jié)構(gòu)為主，多結(jié)節(jié)性生長(zhǎng)、甲狀腺外侵犯、血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移更常見(jiàn)于NTRK1融合PTC[9]。本組7例中NTRK3融合型PTC大部分為濾泡亞型，僅有1例NTRK1融合型PTC為濾泡亞型，混合少量乳頭結(jié)構(gòu)。兒童NRPTC與兒童BRAF突變PTC相比，其腫瘤體積更大，更常見(jiàn)淋巴管血管內(nèi)癌栓，可伴大量砂粒體形成[12,17]。PTC中NTRK重排與BRAF V600E突變一般不共存[4]，極少部分病例可共存[5]，本組7例NRPTC均無(wú)BRAF V600E突變。

目前，NTRK重排的分子檢測(cè)方法有FISH、RT-PCR、NGS等[3]。由于上述檢測(cè)費(fèi)用較昂貴且耗時(shí)較長(zhǎng)，可采用免疫組化法進(jìn)行初篩，對(duì)免疫組化結(jié)果可疑者再行分子檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)[8]。Lee等[10]對(duì)12例經(jīng)FISH檢測(cè)證實(shí)的NRPTC行pan-TRK免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示：pan-TRK預(yù)測(cè)NTRK突變的敏感性約58.3%，特異性100%。Nozaki等[3]研究顯示：18例pan-TRK陽(yáng)性患者中僅2例存在NTRK重排。本組發(fā)現(xiàn)pan-TRK不僅存在染色強(qiáng)度的異質(zhì)性，還存在陽(yáng)性比例的異質(zhì)性。本組7例NRPTC中pan-TRK染色均為2+～3+，且BRAF突變陰性；在本組行pan-TRK染色的176例PTC中，有個(gè)別非NTRK重排PTC中pan-TRK染色也表現(xiàn)為2+甚至3+，但這些病例BRAF突變均為陽(yáng)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的大部分PTC中NTRK重排和BRAF突變不共存的觀點(diǎn)一致；而pan-TRK 1+者暫未發(fā)現(xiàn)NTRK重排。本實(shí)驗(yàn)對(duì)NTRK重排和pan-TRK免疫組化評(píng)分的一致性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示pan-TRK免疫組化結(jié)合BRAF突變檢測(cè)可以作為NRPTC的初篩方法。本研究中NRTK分子檢測(cè)數(shù)據(jù)有限，對(duì)于pan-TRK 1+和陰性病例仍需更進(jìn)一步分析。

PTC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法為手術(shù)切除，行或不行放射碘131治療。NRPTC可能有獲得性碘治療抵抗，對(duì)這些患者應(yīng)尋找其他治療方式[3]。目前，靶向藥物拉羅替尼和恩曲替尼已獲得FDA批準(zhǔn)，可用于NTRK重排實(shí)體瘤的治療[18]。有研究顯示拉羅替尼治療NTRK融合的實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)客觀緩解率達(dá)76%，完全緩解率16%，其相對(duì)安全[19]。對(duì)于放射碘131治療無(wú)效的NRPTC患者使用拉羅替尼治療可能實(shí)現(xiàn)完全緩解[20]。

NRPTC臨床更具有侵襲性，常伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，鏡下大多呈浸潤(rùn)性、多結(jié)節(jié)生長(zhǎng)方式，并常伴甲狀腺內(nèi)外淋巴管血管播散。組織學(xué)特征有腎小球樣結(jié)構(gòu)、大小濾泡/實(shí)性混雜生長(zhǎng)、胞質(zhì)淡染、乳頭核極性反轉(zhuǎn)、核“圓”胞質(zhì)少。pan-TRK免疫組化染色可以作為NRPTC分子檢測(cè)前的初篩方法，對(duì)于pan-TRK 2+～3+者需行NTRK分子檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證，而pan-TRK陰性及1+者，如有相關(guān)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)亦建議行NTRK分子檢測(cè)。pan-TRK在PTC中的判讀標(biāo)準(zhǔn)仍有待收集更多病例進(jìn)一步驗(yàn)證。