王雪梅，程 玉，齊潔敏

2020年WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)最新數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和致死率均位居惡性腫瘤的第4位，病死率高達(dá)7.7%[1]。中國(guó)是胃癌的高發(fā)地區(qū)，約為全球平均水平的2倍，發(fā)現(xiàn)時(shí)常已為中晚期，治療手段較局限，且其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高，術(shù)后5年生存率僅為20%，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。胃癌的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，不僅與異常增殖、凋亡相關(guān)，與自噬亦密不可分。自噬是一個(gè)維持細(xì)胞正常生理功能、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，進(jìn)而高度精確調(diào)控腫瘤形成的過程[3-4]。IL-32作為腫瘤微環(huán)境中的一種炎癥因子，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展緊密相連，對(duì)于調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等具有重要作用[5]，但是否通過自噬影響此類現(xiàn)象還有待探究。本文旨在探究IL-32對(duì)胃癌細(xì)胞自噬的影響及可能的作用機(jī)制，為胃癌的精準(zhǔn)治療開辟新路徑。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、純水機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，制冰機(jī)(日本SANYO公司)；搖床(北京六一生物公司)。

1.2 主要試劑人胃癌細(xì)胞株MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901和正常胃上皮細(xì)胞GES-1購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，IL-32 siRNA(廣州銳博生物公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000(美國(guó)Invitrogen公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)，GAPDH內(nèi)參抗體(美國(guó)Cell Signal公司)，Goat Anti-Mouse IgG-HRP和Goat Anti-rabbit IgG-HRP(美國(guó)KPL公司)，IL-32、p-mTOR、mTOR、p-AKT、AKT抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司)、p110α、p85α、p62、Beclin1、LC3抗體(中國(guó)武漢三鷹生物公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)選擇1株正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和4株胃癌細(xì)胞MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901。其中GES-1、MGC-803、BGC-823、SGC-7901細(xì)胞使用10%RPMI-1640培養(yǎng)基，AGS細(xì)胞使用10%F12培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)而定，待細(xì)胞密度達(dá)90%以上時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需進(jìn)行傳代、種板以及凍存，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天下午將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔板中，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在50%左右，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別轉(zhuǎn)染siNC、siIL-32#1及siIL-32#2組(siIL-32#1：5′-GGGAGAGCUUUU GUGACCA-3′，siIL-32#2：5′-CGGCUUAUUAUGAG GAGCA-3′)。稀釋轉(zhuǎn)染試劑：將4 μL Lipo3000試劑溶于125 μL無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min；稀釋siRNA：將7.5 μL siRNA儲(chǔ)存液溶于125 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻，將稀釋后的siRNA加入稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑中，靜置15 min。取前一天接種的6孔板，棄掉舊培養(yǎng)基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基，再對(duì)應(yīng)加入250 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物溶液，輕微搖勻，置于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～8 h后更換為10%的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3免疫熒光技術(shù) 取轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，將爬片置于24孔板中，分別對(duì)應(yīng)加入100 μL細(xì)胞懸液，然后加入600 μL 10%完全培養(yǎng)基，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，棄上清，PBS洗5 min×3次。預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗5 min×3次。2%BSA封閉液封閉2 h。棄封閉液，加入一抗LC3(稀釋比1∶50)，4 ℃孵育過夜。次日取出，PBS洗5 min×3次。孵育熒光二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗5 min×3次。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育5 min，PBS洗5 min×3次。進(jìn)行封片，立即在熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照觀察。

1.3.4Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，在冰上用細(xì)胞裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)，提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白濃度采用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行測(cè)定，配好蛋白樣本后，100 ℃變性8 min。配制10%分離膠及5%濃縮膠，采用SDS-PAGE凝膠電泳，以30 μg/15 μL體系加樣進(jìn)行電泳，175 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%奶粉或5%BSA封閉液封閉2 h，孵育一抗(抗體稀釋比1∶1 000)，4 ℃過夜。次日取出，TBST洗10 min×3次。二抗37 ℃孵育1 h(抗體稀釋比1∶10 000)，TBST洗10 min×3次。ECL超敏發(fā)光顯色試劑盒顯色，使用Image J分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞系中IL-32的表達(dá)Western blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞系MGC-803、AGS、BGC-823、SGC-7901及胃正常上皮細(xì)胞系GES-1中IL-32的表達(dá)。與GES-1(0.704±0.024)相比，MGC-803(1.267±0.085)、AGS(1.269±0.047)細(xì)胞中IL-32蛋白明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此兩株細(xì)胞進(jìn)行基因沉默。

圖1 Western blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MGC-803、AGS、BCC-823、SGC-7901和胃正常上皮細(xì)胞株GES-1中IL-32蛋白的表達(dá)：與GES-1相比，MGC-803和AGS細(xì)胞中IL-32蛋白顯著高表達(dá)，***P<0.001

2.2 IL-32沉默效率為確保實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，應(yīng)用Western blot法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察和驗(yàn)證。在MGC-803和AGS細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組(siNC)(1.071±0.029、1.071±0.029)相比，siIL-32#1組(0.482±0.018、0.478±0.038)和siIL-32#2組(0.473±0.01、0.525±0.026)蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)均在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下進(jìn)行。

圖2 Western blot法驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效率：與siNC組相比，siIL-32#1和siIL-32#2組蛋白表達(dá)水平顯著降低，***P<0.001

2.3 沉默IL-32基因?qū)ξ赴┘?xì)胞自噬的影響MGC-803、AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染IL-32 siRNA，熒光顯微鏡下觀察并定量LC3熒光斑點(diǎn)。與siNC組相比，轉(zhuǎn)染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細(xì)胞MGC-803和AGS細(xì)胞的LC3熒光斑點(diǎn)數(shù)量顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。說明沉默IL-32基因可促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬。

圖3 沉默IL-32基因?qū)ξ赴┘?xì)胞自噬的影響：與siNC組相比，轉(zhuǎn)染siIL-32#1和siIL-32 #2的胃癌細(xì)胞MGC-803和AGS中自噬熒光斑點(diǎn)量顯著增多，***P<0.001

2.4 IL-32對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細(xì)胞MGC-803中p62的相對(duì)表達(dá)量為0.244±0.051和0.339±0.025，其在AGS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量(0.427±0.028、0.392±0.033)明顯低于siNC組(0.948±0.015、1.056±0.043)。Beclin1(MGC-803：0.783±0.047、0.921±0.021；AGS：0.973±0.034、1.085±0.082)、LC3-Ⅱ(MGC-803：1.080±0.015、1.006±0.024；AGS：0.826±0.083、0.777±0.174)與siNC組(MGC-803：0.948±0.015、0.948±0.015；AGS：0.647±0.039、0.223±0.038)相比表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)：與siNC相比，MGC-803和AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-32 siRNA后，siIL-32#1組和siIL-32#2組p62表達(dá)降低，Beclin1和LC3-Ⅱ表達(dá)升高，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 IL-32對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響轉(zhuǎn)染siIL-32#1和siIL-32#2的胃癌細(xì)胞MGC-803中p-mTOR/mTOR的相對(duì)表達(dá)量為0.298±0.037和0.352±0.034，在AGS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為0.492±0.011和0.425±0.039，明顯低于siNC組(0.870±0.032和0.933±0.052)。p-AKT/AKT(MGC-803：0.330±0.013、0.432±0.028；AGS：0.582±0.016、0.482±0.043)，p110α(MGC-803：0.714±0.022、0.901±0.030；AGS：0.504±0.023、0.550±0.008)，p85α(MGC-803：0.296±0.023、0.642±0.063；AGS：0.364±0.030、0.417±0.046)較siNC組(MGC-803：1.130±0.030、1.061±0.026、1.144±0.024；AGS：1.177±0.018、1.058±0.017、1.075±0.027)表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 Western blot法檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)：與siNC組相比，MGC-803和AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-32 siRNA后，siIL-32#1和siIL-32#2組p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表達(dá)水平明顯降低，而mTOR和AKT總蛋白水平保持不變或略升高，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

白介素(interleukin, IL)家族是人類機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌而成，可根據(jù)其性質(zhì)分為趨化因子、炎癥因子和其他因子三類，IL家族成員參與眾多炎癥性疾病和惡性腫瘤的形成。相關(guān)研究表明[6-8]，IL家族種類多樣，功能復(fù)雜，IL-1β可通過自噬作用調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的形成；在膽管癌的預(yù)后治療中，IL-6可通過自噬過程發(fā)揮診斷作用；IL-12可促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡和自噬，從而抑制肝癌的發(fā)生與發(fā)展；王麗華等[9]研究還發(fā)現(xiàn)，IL-17A可以通過調(diào)節(jié)自噬降低卵巢癌細(xì)胞的敏感性。

IL-32是IL家族中重要一員，位于人類第16號(hào)染色體上，由705個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量為3.2×104，IL-32在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5,10]。研究表明，IL-32在肺癌[11]、肝癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、食管癌及胃癌[14]等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制是否與自噬相關(guān)目前尚不清楚。炎癥和自噬與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制均具有相關(guān)性，機(jī)體的適度自噬在能量代謝、免疫調(diào)控以及細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用，而自噬失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)匱乏，無法發(fā)揮正常的生理功能，從而加速細(xì)胞死亡[15]。LC3是自噬的標(biāo)志蛋白，在激活狀態(tài)下，LC3-Ⅰ會(huì)與磷脂酸乙醇胺結(jié)合成為L(zhǎng)C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ進(jìn)一步與泛素結(jié)合支架蛋白p62結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致自噬溶酶體不能被降解，自噬過程受損[16-17]。

為探索IL-32對(duì)胃癌細(xì)胞自噬的影響，本實(shí)驗(yàn)選用2條siRNA鏈轉(zhuǎn)染MGC-803和AGS細(xì)胞，通過免疫熒光技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：沉默IL-32可增加LC3熒光斑點(diǎn)的數(shù)量，促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬；采用Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：與siNC組相比，siIL-32#1和siIL-32#2組p62表達(dá)降低，而Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)升高。這些結(jié)果表明IL-32抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在抑制自噬調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞發(fā)生自噬的重要調(diào)控途徑[19]，PI3K由p85調(diào)節(jié)亞基和p110催化亞基構(gòu)成，PI3K可磷酸化AKT，進(jìn)而激活下游基因mTOR，其是自噬信號(hào)通路的主要靶點(diǎn)，促進(jìn)mTOR與自噬相關(guān)因子絲氨酸激酶1相互作用，最終觸發(fā)自噬[20]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路上的PI3K亞基p110α和p85α以及下游蛋白p-AKT和p-mTOR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與siNC組相比，轉(zhuǎn)染siIL-32#1和siIL-32#2組胃癌細(xì)胞的p-mTOR、p-AKT、p110α、p85α表達(dá)水平明顯降低。上述結(jié)果表明IL-32抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬，可能與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

綜上，IL-32抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。然而IL-32調(diào)控該信號(hào)通路的機(jī)制目前尚不明確，這是本課題組下一步要解決的重要問題。