門(mén) 慧，談 順

我國(guó)胃癌的發(fā)病率及病死率均較高，分別位居惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的第2位和第3位，患者5年生存率約35.1%，嚴(yán)重危害人類健康[1-2]。類表皮生長(zhǎng)因子域?qū)儆贓GF重復(fù)超級(jí)家族，其中EGFL6是重要成員之一，又被命名為MAGE[3-4]。EGFL6與多種腫瘤密切相關(guān)，可以通過(guò)刺激腫瘤血管形成進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌[5-7]、乳腺癌[8]的侵襲及轉(zhuǎn)移。本組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)EGFL6在胃癌組織中高表達(dá)，與胃癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，并能促進(jìn)胃癌血管形成[9]。本文著重探討EGFL6表達(dá)在胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，以提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014～2016年中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院存檔的40例胃癌手術(shù)標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放、化療，男性21例，女性19例，年齡39～58歲，中位年齡48.5歲。另選取距癌組織5 cm以上的癌旁正常胃黏膜組織作為對(duì)照。

1.2 細(xì)胞及試劑胃癌細(xì)胞株來(lái)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司，胰酶購(gòu)自Life公司，EGFL6抗體購(gòu)自Abcam公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司，Boyden小室購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株(MGC803/MOCK、MGC803/EGFL6)置于10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 選取狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞株，消化細(xì)胞株鋪96孔板，每孔鋪1×103個(gè)細(xì)胞，每孔總體積100 μL；每組設(shè)計(jì)5個(gè)目的復(fù)孔，1個(gè)blank對(duì)照孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7天。鋪板24 h后于酶標(biāo)儀中測(cè)450 nm處各孔吸光度值(OD值)，連測(cè)7天，最后繪制增殖曲線。

1.3.3Transwell實(shí)驗(yàn) 選取狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞株，Boyden小室預(yù)處理：小室濾膜鋪基質(zhì)膠(每小室50 μL)，置于超凈臺(tái)紫外照射2 h殺菌，消化細(xì)胞株，上室加入200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2.0×105個(gè))，下室加入10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)48 h，取出小室，進(jìn)行清洗、固定、染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)，200倍光鏡下隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍圖，并取其均值。

1.3.4裸鼠肺定植實(shí)驗(yàn) 2組4～6周齡裸鼠，每組5只，每只尾靜脈注射5×106個(gè)細(xì)胞，28天后解剖裸鼠，取其肺臟并觀察肺轉(zhuǎn)移情況，10%中性福爾馬林固定標(biāo)本、取材、包埋、制片，光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移情況。

1.3.5免疫組化 免疫組化染色采用SP法，提前烤石蠟切片6～8 h，脫蠟、脫水、抗原修復(fù)、阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉、加入一抗4 ℃冰箱過(guò)夜、生物素標(biāo)記二抗、加入辣根過(guò)氧化物酶工作液、DAB顯色、染色及制片。判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色程度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：3～4分為陰性，5～7分陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組均數(shù)間比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，生長(zhǎng)時(shí)間、增殖能力、時(shí)間與分組之間比較用析因方差分析，免疫組化結(jié)果與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析用χ2檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中EGFL6蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)顯示，EGFL6蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)，胃癌組織中28例EGFL6蛋白陽(yáng)性(70%，28/40)，癌旁正常胃黏膜組織中5例EGFL6蛋白陽(yáng)性(12.5%，5/40)，與癌旁正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中EGFL6的表達(dá)量明顯上調(diào)(χ2=27.29，P<0.001)。

圖1 EGFL6在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，SP法：A.胃癌組織中陽(yáng)性；B.癌旁正常胃黏膜組織中陰性

2.2 胃癌組織中EGFL6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系EGFL6表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)相關(guān)性，與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性(P均<0.05，表1)。

表1 胃癌組織中EGFL6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞的增殖能力變化MGC803/MOCK組與MGC803/EGFL6組相比，細(xì)胞株生長(zhǎng)時(shí)間差異有顯著性(F=290.9，P<0.000 1)，細(xì)胞增殖能力差異有顯著性(F=572.3，P<0.000 1)，時(shí)間與分組之間的交互效應(yīng)顯著(F=40.45，P<0.000 1)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)EGFL6后細(xì)胞增殖速度明顯增加，提示EGFL6表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外增殖能力(表2，圖2)。

表2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFL6后對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響

圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞株的體外增殖情況

2.4 過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞的侵襲能力變化與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組穿過(guò)小室膜細(xì)胞數(shù)目明顯增多(t=11.34，P<0.000 1)。結(jié)果表明，EGFL6表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的體外侵襲能力(圖3)。

圖3 Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞株的體外侵襲情況

2.5 過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞的肺定植能力變化與MGC803/MOCK組相比，MGC803/EGFL6組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯多于對(duì)照組(t=6.200，P=0.000 3)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)EGFL6可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力(圖4)。

圖4 裸鼠尾靜脈肺定植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)EGFL6后MGC803細(xì)胞株體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移情況：A.肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)大體圖；B.肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)鏡下圖；C.肺轉(zhuǎn)移灶統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

EGFL6屬于EGF重復(fù)超級(jí)家族，包涵1個(gè)N端信號(hào)肽，屬于一種分泌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其參與細(xì)胞周期、增殖、發(fā)育調(diào)節(jié)、血管形成及腫瘤演進(jìn)等[10-12]。文獻(xiàn)已報(bào)道，EGFL6可以調(diào)控ALDH+卵巢癌細(xì)胞的不對(duì)稱分裂、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]，EGFL6通過(guò)CRISPR/Cas9信號(hào)通路調(diào)控卵巢癌增殖、侵襲及血管形成[6]，miR-6086通過(guò)下調(diào)OC2/VEGFA/EGFL6軸抑制卵巢癌血管生成[7]。EGFL6可以增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及刺激腫瘤血管形成，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[8]。EGFL6可以作為肺腺癌預(yù)后標(biāo)志物[13]。EGFL6在結(jié)直腸癌中高表達(dá)并通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌增殖和遷移[14-15]；EGFL6促進(jìn)食管癌增殖、侵襲和遷移[16]。EGFL6通過(guò)AKT信號(hào)通路，促進(jìn)鼻咽癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[17]；EGFL6在胃癌組織中高表達(dá)[9,18]；EGFL6能夠促進(jìn)胃癌血管形成[9]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)的場(chǎng)所，血管可以源源不斷提供營(yíng)養(yǎng)成分[19-20]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。

本組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)EGFL6 mRNA在胃癌組織中高表達(dá)并與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)旁分泌EGFL6蛋白刺激胃癌血管形成[9]，腫瘤發(fā)展過(guò)程中需要足夠豐富的血管源源不斷提供營(yíng)養(yǎng)支持，胃癌細(xì)胞通過(guò)自身旁分泌EGFL6蛋白刺激血管形成，為其提供足夠的養(yǎng)分。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究EGFL6是否在胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用。

本組免疫組化結(jié)果顯示，EGFL6蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。過(guò)表達(dá)EGFL6后，胃癌細(xì)胞MGC803增殖、侵襲及裸鼠尾靜脈肺定植能力均增強(qiáng)，說(shuō)明EGFL6與胃癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)合本組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出胃癌細(xì)胞通過(guò)自身旁分泌EGFL6蛋白，刺激胃癌血管形成，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移，為臨床抗腫瘤治療提供新的靶向參考，具體作用機(jī)制還有待深入探究。