鄭小影，郭新建，陳瑞慧，王豐梅，冶俊玲，慧 芳

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1標本來源 收集2018～2020年青海大學附屬醫(yī)院胃腸外科行CRC根治性手術的80例CRC癌組織及癌旁正常組織石蠟標本，患者年齡40～75歲，平均(50.2±4.5)歲。納入標準：所有患者均未接受術前放、化療及靶向治療；排除標準：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤。所有病例均經(jīng)病理科高年資醫(yī)師會診后確診，本實驗經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準通過，且患者均知情同意。

1.1.2細胞系 CRC細胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細胞NCM460均購自上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基、血清(美國Gibco公司)，Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)，RASSF7抗體(美國Origene公司)，RASSF7 plasmid、ShRNA及ShNC(中國GenePhrma公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，MTT及DMSO(武漢華美公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，免疫組化試劑及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3 方法

1.3.1生物信息學分析 基于GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)使用標準的處理管分析來自GTEx和TCGA數(shù)據(jù)庫中結腸癌(colon adenocarcinoma, COAD)和直腸癌(rectum adenocarcinoma, READ)的667例正常樣本和367例腫瘤樣本的RASSF7 RNA測序表達數(shù)據(jù)。

1.3.2免疫組化及結果判讀 (1)染色：切取4 μm厚石蠟切片，具體操作步驟嚴格按免疫組化SP試劑盒及DAB顯色說明書進行，陰性對照選用PBS代替一抗。(2)判讀標準：RASSF7蛋白在CRC中的表達主要定位于細胞質。根據(jù)著色細胞百分比評分：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；根據(jù)染色強度評分：未著色為0分，淺黃色顆粒為1分，深黃色或黃褐色顆粒為2分。將兩項評分相乘即為該切片的最終得分(0～8分)：≤4分定義為低表達，>4分定義為高表達。

1.3.3Western blot 收集待測細胞，提取總蛋白，蛋白定量并配制為同一濃度后煮沸至蛋白變性。10% SDS-PAGE的凝膠電泳，PVDF膜轉膜。5%BSA封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入對應的二抗，25 ℃孵育2 h。ECL顯色劑發(fā)光，Bio-Image系統(tǒng)測定條帶灰度值，將其與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

在使用奧斯本檢核表檢核實驗方案時，可以圍繞實驗目的將9個檢核項目進一步細化，拓展出多個不同的問題進行思考，通過小組討論合作探究，形成新的實驗思路或方案，具體檢核方法見表1。

1.3.4細胞培養(yǎng)與轉染 SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及NCM460置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。每1～2天換液1次。取對數(shù)生長期的SW480和HCT116細胞接種于6孔板，待細胞密度達60%，采用Lipofectamine 3000對細胞進行瞬時轉染。轉染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.3.5MTT法檢測細胞增殖能力 將轉染24 h的細胞按每孔100 μL培養(yǎng)基中含1 000個細胞的密度接種于96孔板中，分別于24、48、72、96、120 h收集細胞，測吸光度。各組細胞加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，水平震蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490 nm處各孔的吸光度(A)，實驗重復3次，取平均數(shù)，繪制細胞生長曲線。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 細胞轉染24 h后，將5×105個細胞接種到不含血清、鋪有基質膠的Transwell上室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，擦掉表面非侵襲的細胞，用10%中性福爾馬林固定剩余細胞，蘇木精染色。隨機選取10個視野，計數(shù)侵襲到小室下的細胞數(shù)。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 CRC組織中RASSF7的表達基于GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，定義|Log2FC|≤1，P<0.05時，RASSF7在COAD、READ癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05，圖1)。

圖1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結腸癌和直腸癌癌組織及癌旁正常組織中RASSF7的表達：*P<0.05

本組應用免疫組化檢測80例CRC組織及對應癌旁正常組織中RASSF7蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)CRC組織中RASSF7高表達50例，低表達30例，CRC癌組織中RASSF7的表達明顯高于癌旁正常組織(圖2)。RASSF7高表達與TNM分期(P<0.001)及淋巴結轉移(P=0.030)相關；而與患者年齡(P=0.238)、性別(P=0.065)及腫瘤分化程度(P=0.238)無關(表1)。

表1 CRC中RASSF7表達與臨床病理特征的關系

圖2 RASSF7在CRC組織中的表達：A.癌旁正常組織中RASSF7的表達，SP法；B.CRC組織中RASSF7的表達，SP法

2.2 CRC細胞中RASSF7的表達為明確RASSF7在CRC細胞中的表達，本實驗通過Western blot法檢測CRC細胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細胞NCM460中RASSF7蛋白的表達量，結果顯示：與NCM460相比，RASSF7在CRC細胞系中的表達更高(F=55.34，P<0.01，圖3A)。選出RASSF7表達量較低的SW480(NC組：0.36±0.02vsRASSF7組：0.91±0.02)和表達量較高的HCT116(shNC組：0.85±0.03vsShRASSF7組：0.28±0.03)分別進行過表達及敲除，轉染效率均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3B、C)。

圖3 CRC細胞系中RASSF7的表達：A.RASSF7在正常腸上皮細胞及CRC細胞系中的表達；B.SW480細胞株中過表達RASSF7的轉染效率；C.HCT116細胞株中敲除RASSF7的轉染效率；**P<0.01

2.3 RASSF7對CRC細胞增殖能力的影響MTT實驗顯示：SW480細胞株中過表達RASSF7可促進細胞增殖(P<0.01，圖4A)；反之，HCT116細胞株中敲除RASSF7可顯著抑制細胞增殖(P<0.01，圖4B)。

圖4 RASSF7對CRC細胞株增殖能力的影響：A.過表達RASSF7對SW480細胞增殖能力的影響；B.敲除RASSF7對HCT116細胞增殖能力的影響，**P<0.01

2.4 RASSF7對CRC細胞侵襲能力的影響Transwell實驗結果顯示：SW480細胞株過表達RASSF7可促進細胞的侵襲能力(NC組：13.30±16.22vsRASSF7組：320.30±17.29，P<0.01，圖5A)；反之，HCT116細胞株敲除RASSF7可顯著抑制細胞的侵襲能力(shNC組：197.00±9.54vsshRASSF7組：65.00±6.35，P<0.01，圖5B)。

圖5 RASSF7對CRC細胞株侵襲能力的影響：A.SW480中RASSF7過表達的侵襲能力；B.HCT116中RASSF7敲除的侵襲能力，**P<0.01

3 討論

CRC是嚴重威脅人類健康的第四大惡性腫瘤[4-5]。我國青海地區(qū)CRC的發(fā)病率居高不下，可能與喜辣的飲食習慣有關。盡管近年來國內外關于CRC的病因及治療的研究取得了一定進步，但是其發(fā)病率和病死率仍呈增長趨勢[6-7]。多數(shù)CRC患者就診時已為晚期，且CRC的治療常以化療為主，但化療具有高毒性且機體反應相對不敏感[8-10]。因此，通過尋找特異性的分子靶定標志物來提高CRC患者的早期診療效率，進而改善患者預后，提高患者生存率成為迫切需要解決的問題[11]。本實驗結合GEPIA2數(shù)據(jù)庫檢測RASSF7在CRC組織中的表達，并通過臨床樣本和細胞系進行驗證，探究RASSF7對CRC增殖及侵襲的影響。

ANCRASSF7SW480

BshNCshRASSF7HCT116

RASSF蛋白質由10名成員組成，以在其C-端(RASSF1-6)或N-端(RASSF7-10)包含RA結構域(Ras相關區(qū)域)著稱。RASSF7(也稱HRC1基因)位于染色體11p15.5，與傳統(tǒng)RASSFs不同，RASSF7在多種癌細胞系中均有表達[12-13]，且基因芯片結果顯示RASSF7在多種癌組織中表達上調[14-16]，認為其可能促進腫瘤的發(fā)生[17]。

最近很多研究表明，RASSF7在多種癌組織及細胞系中高表達。Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中過表達RASSF7可以促進細胞增殖、抑制凋亡，敲除RASSF7則作用相反，且其通過激活MEK1/2-ERK1/2信號通路發(fā)揮作用。Zheng等[1]證實RASSF7在非小細胞肺癌組織和細胞系中高表達，且通過Hippo信號通路促進細胞增殖、遷移及侵襲。韓艷春等[2]實驗結果提示：乳腺癌中RASSF7高表達且在低氧環(huán)境下可以促進乳腺癌上皮-間質轉化，進而促進細胞侵襲、轉移。崔建利等[18]指出RASSF7在人食管鱗狀細胞癌組織和4種食管癌細胞系中均高表達，提示RASSF7基因表達可能與食管鱗狀細胞癌的惡性程度及轉移相關。以上研究均提示RASSF7可能參與惡性腫瘤的進程。

本實驗通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)：RASSF7在CRC組織中的表達明顯高于癌旁正常組織；進一步通過免疫組化檢測80例CRC臨床樣本結果提示：RASSF7在CRC組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，這與數(shù)據(jù)庫分析結果一致，且RASSF7高表達與TNM分期及淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤分化程度無關(P>0.05)，提示RASSF7高表達可能與CRC的惡性程度及轉移有關；Western blot檢測CRC細胞系SW480、LOVO、HCT116、SW620、RKO及正常腸上皮細胞NCM460中RASSF7的表達發(fā)現(xiàn)，CRC細胞系中RASSF7的表達量均高于NCM460(P<0.01)。本實驗選擇相對低表達RASSF7的SW480和相對高表達RASSF7的HCT116分別進行過表達或敲除RASSF7，結果發(fā)現(xiàn)過表達RASSF7可以促進CRC細胞的增殖及侵襲能力；反之，敲除RASSF7則作用相反。提示RASSF7可能在CRC細胞的增殖及侵襲中發(fā)揮關鍵作用。

綜上，RASSF7在CRC組織和細胞系中高表達，敲除RASSF7后細胞的增殖、侵襲能力均被抑制。然而，RASSF7影響CRC生物學行為的具體分子機制目前尚不清楚，還有待于進一步研究。