劉 靜

肝纖維化是一個(gè)長(zhǎng)期的慢性肝損傷過程，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)的氧自由基過度產(chǎn)生和抗氧化功能相對(duì)減弱導(dǎo)致兩者之間平衡破壞，繼而引起組織或細(xì)胞損傷的一種狀態(tài)[1]。氧化應(yīng)激在肝纖維化中充當(dāng)重要角色[2]。許多致肝損傷因素都伴不同程度的氧化應(yīng)激產(chǎn)生，而Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)-核因子2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路在抵御機(jī)體氧化應(yīng)激過程中起關(guān)鍵作用。在氧化應(yīng)激等狀態(tài)下，Nrf2與Keap1解離，使Nrf2轉(zhuǎn)移入核，啟動(dòng)下游抗氧化保護(hù)性基因的表達(dá)，保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[3]，其中Keap1負(fù)性調(diào)節(jié)Nrf2[4]。本文擬通過構(gòu)建Keap1 shRNA干擾質(zhì)粒，探討Keap1下調(diào)后對(duì)缺氧肝細(xì)胞功能的影響，為臨床肝纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞AML12購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，使用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，常氧培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2和95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中；缺氧培養(yǎng)在1%O2、5%CO2和94%N2培養(yǎng)箱中。

1.2 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染由上海吉瑪公司合成4條Keap1 shRNA干擾質(zhì)粒序列(Plvx/GFP/puro-Keap1-1781、1894、1934、2097)和1條對(duì)照shNC序列。將AML12肝細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至70%～80%融合度時(shí)，用Lipofectamine 2000分別將4條干擾序列及對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至AML12肝細(xì)胞，36 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)轉(zhuǎn)染36 h提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并取1 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒序列。

1.4 Keap1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選將shRNA干擾效率最高的質(zhì)粒序列Keap1 shRNA-1781轉(zhuǎn)染至AML12肝細(xì)胞中，加入1.2 μg/mL嘌呤霉素篩選相應(yīng)的干擾Keap1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.5 Western blot檢測(cè)Keap1、Nrf2、COL3A1、TGF-β1、VEGF-A、IGF-1蛋白表達(dá)將篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株作為Keap1 shRNA組，與對(duì)照組肝細(xì)胞缺氧處理不同時(shí)間，加入RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000g離心10 min，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量后，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，加入相應(yīng)的抗體4 ℃過夜。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯色。以GAPDH作為對(duì)照內(nèi)參。

1.6 ELISA法測(cè)定COL3A1的分泌收集Keap1 shRNA組與對(duì)照組肝細(xì)胞缺氧培養(yǎng)上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算COL3A1濃度。

1.7 WST-1檢測(cè)肝細(xì)胞活性轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA后的肝細(xì)胞與對(duì)照組肝細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，缺氧處理0、6、12、24、48 h。參考說(shuō)明書，每孔加入10 μL WST-1溶液37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%，空白組為具有WST-1溶液而沒有細(xì)胞。

1.8 丙酮酸激酶(PK)活性的測(cè)定轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA的肝細(xì)胞與對(duì)照組肝細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，收集細(xì)胞，加入提取液超聲破碎，8 000g4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。

1.9 ATP含量測(cè)定收集缺氧培養(yǎng)后的Keap1 shRNA組與對(duì)照組肝細(xì)胞，加入酸性提取液，超聲破碎細(xì)胞，8 000g4 ℃離心10 min；取上清，再加入等體積的堿性提取液中和，8 000g4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Keap1 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建本組以Keap1基因第1781、1894、1934、2097位點(diǎn)為干擾點(diǎn)，將shRNA序列與質(zhì)粒載體Plvx/GFP/puro連接，構(gòu)建4種Keap1基因的shRNA質(zhì)粒載體，基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入序列正確(表1)。

表1 Keap1基因的4個(gè)shRNA靶點(diǎn)序列

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Keap1 shRNA-1781、1894、1934、2097的相對(duì)表達(dá)量分別為0.38±0.16、0.42±0.14、0.62±0.18、0.50±0.13，4組重組質(zhì)粒與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中Keap1 shRNA-1781差異最顯著，且表達(dá)量最低，干擾效果最好(圖1A)。Keap1 shNC組相對(duì)表達(dá)量為0.88±0.17，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 Keap1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株建立將Keap1 shRNA-1781轉(zhuǎn)染至肝細(xì)胞36 h后，加入嘌呤霉素，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光，轉(zhuǎn)染效率超過80%，成功篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(圖1B)。

圖1 Keap1 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建篩選：A.qRT-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞中Keap1 shRNA-1781、1894、1934、2097各序列Keap1 mRNA的表達(dá)：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；B.Keap1 shRNA-1781穩(wěn)轉(zhuǎn)肝細(xì)胞株熒光顯微鏡觀察

2.4 Western blot檢測(cè)不同缺氧時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)取轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA后的肝細(xì)胞，分別缺氧處理0、6、12、24、48 h，結(jié)果顯示缺氧能夠增強(qiáng)Nrf2、COL3A1、TGF-β1、VEGF-A、IGF-1蛋白的表達(dá)水平，并且Keap1 shRNA能夠增強(qiáng)Nrf2表達(dá)；與Keap1 shNC組相比，Keap1 shRNA組促肝纖維化相關(guān)因子COL3A1、TGF-β1、VEGF-A、IGF-1的表達(dá)下降，且12 h Keap1 shRNA干擾效果最好(圖2)。

圖2 Keap1 shRNA轉(zhuǎn)染后缺氧培養(yǎng)0、6、12、24、48 h，Western blot檢測(cè)Keap1、Nrf2、COL3A1、TGF-β1、VEGF-A和IGF-1蛋白水平表達(dá)：與同一缺氧時(shí)間點(diǎn)的shNC組比較，*P<0.05，**P<0.01；與常氧下shNC組相比，#P<0.05，##P<0.01；N.常氧；H.缺氧

2.5 ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA對(duì)缺氧肝細(xì)胞COL3A1分泌的影響轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA后，Keap1 shRNA組肝細(xì)胞COL3A1的分泌較對(duì)照組降低(1.14±0.10vs1.89±0.14)(P=0.002，圖3)，并且缺氧能增強(qiáng)肝細(xì)胞COL3A1的分泌。

圖3 Keap1 shRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后缺氧處理，通過ELISA測(cè)定上清中COL3A1的表達(dá)：與缺氧shNC相比，**P<0.01；與常氧shNC組相比，##P<0.01

2.6 WST-1檢測(cè)缺氧肝細(xì)胞的活性在不同缺氧時(shí)間點(diǎn)，與Keap1 shNC組相比，Keap1 shRNA組細(xì)胞活性上升(6 h: Keap1 shRNA 1.18±0.16vsKeap1 shNC 0.96±0.13；12 h：Keap1 shRNA 1.05±0.14vsKeap1 shNC 0.77±0.10，P=0.048；24 h: Keap1 shRNA 0.90±0.12vsKeap1 shNC 0.66±0.09，P=0.045；48 h: Keap1 shRNA 0.61±0.08vsKeap1 shNC 0.43±0.06，P=0.032，圖4)。

圖4 Keap1 shRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后，WST-1法檢測(cè)缺氧處理不同時(shí)間細(xì)胞的活性：與同一時(shí)間點(diǎn)的shNC組相比，*P<0.05

2.7 缺氧肝細(xì)胞能量代謝檢測(cè)缺氧導(dǎo)致無(wú)氧糖酵解相關(guān)酶PK活性和ATP含量下降，而與對(duì)照組相比，Keap1 shRNA轉(zhuǎn)染后的缺氧肝細(xì)胞PK活性(Keap1 shRNA 307.30±43.27vsKeap1 shNC 214.23±36.02)(P=0.045)以及ATP含量均提高(Keap1 shRNA 0.45±0.06vsKeap1 shNC 0.31±0.04)(P=0.041，圖5)。

圖5 Keap1 shRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后，缺氧處理PK活性(A)及ATP的含量(B)：與缺氧shNC組相比，*P<0.05；與常氧shNC組相比，#P<0.05

3 討論

肝纖維化是一個(gè)多種因素引起慢性肝損傷的修復(fù)過程。近年，缺氧及缺氧引起的氧化應(yīng)激與肝纖維化的關(guān)系日益受到關(guān)注，抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷已成為防治肝纖維化的新策略。Keap1作為細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激感受器，抑制Keap1表達(dá)可提高細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激損傷的耐受力，有文獻(xiàn)報(bào)道Keap1基因敲除的小鼠通過增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)，使肝臟免于氧化應(yīng)激損傷[5]，因此Keap1基因是應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的潛在靶點(diǎn)。

以往對(duì)肝纖維化的防治研究主要聚焦于肝星狀細(xì)胞，由于其在肝內(nèi)細(xì)胞群體中占比較小，又處于基質(zhì)包繞的微環(huán)境中，藥物吸收困難，故治療效果并不理想；而肝細(xì)胞最易受到氧化應(yīng)激的損傷[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇肝細(xì)胞作為主要的研究靶點(diǎn)。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，與siRNA相比，shRNA干擾效果穩(wěn)定且持久。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Keap1基因構(gòu)建shRNA干擾載體，轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，取得較好的干擾效果，并篩選Keap1 shRNA-1781為最佳干擾序列。

Nrf2作為細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在防治肝纖維化中起重要作用[7]。Xu等[8]報(bào)道敲除Nrf2基因的小鼠能夠加重CCl4導(dǎo)致的肝纖維化損傷。另一項(xiàng)研究表明金絲桃苷[9]通過上調(diào)Nrf2，增強(qiáng)下游一些抗氧化基因的表達(dá)，減輕CCl4導(dǎo)致的肝纖維化損傷。最近研究報(bào)道扶正化瘀膠囊通過激活Nrf2-Keap1-Are信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抗肝纖維化[10]，表明Nrf2是肝纖維化治療的潛在靶點(diǎn)[11-13]。本組研究顯示Keap1基因下調(diào)后，Nrf2表達(dá)上升。

在肝纖維化中以Ⅰ和Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的重要原因。肝細(xì)胞單獨(dú)合成膠原的能力雖然是肝星狀細(xì)胞的一半，然而在肝內(nèi)細(xì)胞中，肝細(xì)胞的數(shù)目約是肝星狀細(xì)胞的20倍，一旦肝細(xì)胞合成膠原的數(shù)量有所增加，將會(huì)導(dǎo)致大量的膠原合成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，大部分的膠原都是由肝細(xì)胞合成的[14]。同時(shí)損傷肝細(xì)胞合成的膠原也促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活，進(jìn)一步加重肝纖維化。本組結(jié)果顯示Keap1 shRNA能較好地抑制缺氧肝細(xì)胞Ⅲ型膠原的合成和分泌。TGF-β1、VEGF和IGF-1參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，Keap1 shRNA作用于缺氧肝細(xì)胞后，Nrf2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制促纖維化因子TGF-β1、VEGF和IGF-1的表達(dá)，Oh等[15]的研究顯示Nrf2激活能夠通過抑制TGF-β1來(lái)抑制肝纖維化。

缺氧影響細(xì)胞的活性，然而轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA后肝細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境產(chǎn)生一定的耐受力，使肝細(xì)胞活性上升。有研究報(bào)道[16]Nrf2缺失或Keap1基因敲除能夠降低肝細(xì)胞活性。另外，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2通過上調(diào)糖酵解關(guān)鍵基因調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中的代謝重編程。本實(shí)驗(yàn)顯示Keap1下調(diào)能夠加強(qiáng)無(wú)氧酵解關(guān)鍵酶PK的活性，提高缺氧肝細(xì)胞的ATP水平，進(jìn)一步證實(shí)干擾Keap1后，可能通過增強(qiáng)Nrf2表達(dá)產(chǎn)生抗缺氧效應(yīng)，從而緩解缺氧肝細(xì)胞的能量代謝障礙。然而，與缺氧耐受有關(guān)的許多基因都受缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)節(jié)，其中包括促紅細(xì)胞生成素和無(wú)氧糖酵解相關(guān)的酶等。Keap1是否通過影響缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)調(diào)節(jié)缺氧耐受，還有待進(jìn)一步探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建Keap1 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞株，Keap1下調(diào)后能夠降低促纖維化因子的表達(dá)，提升缺氧條件下的肝細(xì)胞能量代謝。然而，肝纖維化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步觀察Keap1-Nrf2信號(hào)通路在肝纖維化中的調(diào)控作用，為預(yù)防和治療肝纖維化提供新的思路和途徑。