武 蓓， 師尚禮， 張輝輝， 張曉燕， 吳 芳， 王文娟， 何 龍， 劉旵旵

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)隸屬于豆科苜蓿屬，多年生草本植物，是我國廣泛栽培的優(yōu)良牧草，不僅可以作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼草，而且能夠改善生態(tài)環(huán)境，是人工草地栽培和天然草地改良的優(yōu)勢草種。然而，當(dāng)紫花苜蓿用于生態(tài)草地建植時(shí)，其通過自身分泌、地上部淋溶及殘?bào)w分解等方式從供體植株各器官向周圍環(huán)境中釋放自毒物質(zhì)，直接或間接地對次代受體苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長產(chǎn)生抑制作用[1-2]，嚴(yán)重影響了放牧型生態(tài)草地群落更新的穩(wěn)定性[3]，造成苜蓿生態(tài)草地的斷崖式衰退。研究發(fā)現(xiàn)，萜類、生物堿及酚酸類物質(zhì)等均是造成紫花苜蓿自毒作用的次生代謝物質(zhì)[4-5]，且受到苜蓿本身遺傳特性的影響，自毒物質(zhì)種類和含量因苜蓿品種不同存在差異，其中香豆素是紫花苜蓿的主要自毒物質(zhì)，在供體紫花苜蓿中含量最高[6]。榮思川和李志華等均對不同紫花苜蓿品種地上部和地下部主要酚酸類自毒物質(zhì)含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)香豆素含量最高，且不同品種的不同部位自毒物質(zhì)含量存在差異[7-8]。盧成等采用高效液相色譜法測定苜蓿酚酸類自毒物質(zhì)的含量，表明香豆素、咖啡酸的含量相對較高[9]。而后有學(xué)者相繼就香豆素對受體紫花苜蓿的自毒效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，通過外源添加自毒物質(zhì)模擬試驗(yàn)均證明香豆素能抑制苜蓿種子萌發(fā)、根系形態(tài)建成和幼苗生長，對苜蓿植株的自毒效應(yīng)最顯著[10-11]。此外，香豆素作為紫花苜蓿的重要自毒物質(zhì)，其含量受遺傳因素、生態(tài)條件以及生長發(fā)育階段等因素的影響，各因素對香豆素含量的影響都直接反映到苜蓿生理生化代謝上。因此，研究影響不同紫花苜蓿香豆素含量差異的內(nèi)在理化因素對于闡明香豆素合成機(jī)理，進(jìn)一步培育低香豆素含量的紫花苜蓿品種具有重要作用。

香豆素是一類來源于苯丙烷類代謝途徑的次生代謝物，其合成是從光合作用產(chǎn)生蔗糖和淀粉等光合產(chǎn)物開始，后經(jīng)蔗糖-淀粉代謝促進(jìn)光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖經(jīng)過糖酵解和磷酸戊糖途徑為莽草酸途徑和苯丙烷類代謝物的合成提供能量和前體物質(zhì)[12]。有關(guān)次生代謝物與光合作用之間關(guān)系的研究表明，莽草酸及苯丙烷等代謝過程與植物光合作用具有一定相關(guān)性[13]。Luo等通過對不同香豆素含量的草木樨種質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因富集在碳代謝以及碳代謝相關(guān)途徑，如光合碳同化、糖酵解和淀粉-蔗糖代謝，且多數(shù)富集到這部分代謝途徑的差異表達(dá)基因在香豆素含量高的種質(zhì)中表達(dá)量上調(diào)[14]。程水源等從生理生化角度探究各指標(biāo)與次級代謝產(chǎn)物含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量與黃酮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，色素的降解可以促進(jìn)次級代謝物的合成[15]。隨著植物體內(nèi)自毒物質(zhì)的積累，光合作用逐漸減弱，出現(xiàn)光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化過程減慢，光合速率下降等現(xiàn)象[16]。初生代謝產(chǎn)物可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化會(huì)影響香豆素的合成，香豆素含量與可溶性糖含量的變化呈正相關(guān)關(guān)系，而蛋白質(zhì)和香豆素由于存在共同前體物質(zhì)苯丙氨酸，二者的關(guān)系有兩種可能：競爭關(guān)系或者通過促進(jìn)光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化而含量均提高[17]。近年來，有關(guān)自毒的研究多集中在不同植物各類自毒物質(zhì)含量差異及次代植物對自毒脅迫的生理和分子響應(yīng)等方面，但有關(guān)供體紫花苜蓿香豆素含量高低的內(nèi)在影響因素以及香豆素合成機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。紫花苜蓿品種差異是否影響其光合生理特性，進(jìn)而影響香豆素的合成有待研究？因此，本研究在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，從當(dāng)代供體紫花苜蓿香豆素合成代謝途徑角度出發(fā)，通過比較不同紫花苜蓿品種香豆素含量及光合生理差異，探究光合生理對香豆素含量的影響，為后續(xù)深入探討高香豆素和低香豆素紫花苜蓿香豆素合成差異提供理論依據(jù)，同時(shí)也為培育低香豆素紫花苜蓿品種及解決苜蓿自毒障礙奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種：‘甘農(nóng)9號’、‘隴東苜?！?、‘隴中苜?！?、‘MF4114’、‘MF4010’和‘3105c’均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；‘WL656HQ’購自北京正道生態(tài)科技有限公司；‘新牧4號’和‘清水苜?！尚陆r(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用營養(yǎng)液沙培法，于2021年3—4月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院光照培養(yǎng)室培養(yǎng)苜蓿幼苗，光照培養(yǎng)室參數(shù)設(shè)置為光通量密度400 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度分別為(25±1)℃和(20±1)℃，相對濕度60%左右，每天光照14 h。將細(xì)沙經(jīng)121℃高溫滅菌26 min后，裝入口徑為9 cm，高度為11 cm的營養(yǎng)缽中，擺放在長×寬×高為25 cm×15 cm×10 cm的水培盒中。選取飽滿且大小一致的不同品種紫花苜蓿種子，經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒5 min后用蒸餾水沖洗干凈，播種前用吸水紙吸干，均勻地播種在營養(yǎng)缽中，播種后置于光照培養(yǎng)室。出苗后間苗，每缽保留生長一致、分布均勻的幼苗10株，每隔2 d澆300 mL Hoagland營養(yǎng)液，保證幼苗正常生長。在出苗后第45 d采集苜蓿幼苗葉片，3次重復(fù)，液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3 測定內(nèi)容及方法

1.3.1香豆素含量的測定 采集好的苜蓿樣品陰干粉碎后過1 mm篩子，室溫保存用于香豆素含量測定。

香豆素的提取：參照湯春妮的方法稍有改進(jìn)[18]。稱取0.5 g待測樣品于試管中，加入10 mL 60%的乙醇，搖勻后在30℃下超聲提取40 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液至50 mL離心管中，重復(fù)提取3次，合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至干。

香豆素含量的測定：采用分光光度法。濃縮后定容至50 mL的容量瓶中，374 nm處測定吸光值。

1.3.2光合參數(shù)的測定 采用德國GFS-3000便攜式氣體交換熒光系統(tǒng)于光照充足的上午9：00—11：00，測定供試苜蓿第3片完全展開真葉的光合參數(shù)。葉室溫度為25℃，CO2濃度為380 μmol·m-2·s-1，光強(qiáng)為1 200 μmol·m-2·s-1，相對濕度60%左右。計(jì)算凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(E)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)[19-21]。各處理3次重復(fù)，每次重復(fù)取3個(gè)葉片進(jìn)行光合參數(shù)的測定。

1.3.3葉綠素含量的測定 參照鄒琦[22]的方法，采用丙酮乙醇混合液提取法，取苜蓿新鮮葉片，測定葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)以及葉綠素(a+b)[Chl(a+b)]含量。各處理3次重復(fù)。

1.3.4光合產(chǎn)物的測定 取苜蓿新鮮葉片測定光合產(chǎn)物含量，各處理3次重復(fù)。

蔗糖(Suc)含量：采用蔗糖含量試劑盒(購于蘇州格銳思生物有限公司)測定。

淀粉(Sta)含量：采用高氯酸水解-蒽酮比色法測定[23]。

可溶性糖(SS)含量：采用蒽酮比色法測定[24]。

可溶性蛋白(SP)含量：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[25]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和計(jì)算；采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)性分析，并用通徑分析法分析供試紫花苜蓿品種光合生理相關(guān)指標(biāo)對香豆素的直接效應(yīng)。利用下列公式計(jì)算光合生理指標(biāo)對香豆素含量的間接通徑系數(shù)和決策系數(shù)。

間接通徑系數(shù)的計(jì)算：

間接通徑系數(shù)=rijPjy

(1)

式(1)中，間接通徑系數(shù)rijPjy反映了自變量xi通過自變量xj對因變量y的影響效應(yīng)，xi表示直接自變量，xj表示間接自變量。rij表示xi與xj的簡單相關(guān)系數(shù)，Pjy表示自變量xj對因變量y的直接影響效應(yīng)(即直接通徑系數(shù))。

決策系數(shù)：通徑分析可以清楚地反映自變量對因變量的直接和間接作用，但難以確定自變量xi通過x1，x2，…，xj對y的綜合決定作用。決策系數(shù)是通徑分析中的決策指標(biāo)[26]，表示各自變量對因變量的綜合決定作用，決策系數(shù)最大的為主要決定因子，而決策系數(shù)為負(fù)值且最小的為主要限定因子[27]。計(jì)算采用公式為：

R2=2Piyriy-Piy2

(2)

式(2)中，Piy表示自變量xi對因變量y的直接影響效應(yīng)(即直接通徑系數(shù))。riy表示自變量xi與因變量y的簡單相關(guān)系數(shù)。R2可以是正數(shù),也可以是負(fù)數(shù)，若R2>0,說明xi對y起增強(qiáng)作用；若R2<0,說明xi對y起限定性作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紫花苜蓿品種的香豆素含量差異

由圖1可知，不同紫花苜蓿品種葉片中的香豆素含量存在差異。9個(gè)紫花苜蓿品種香豆素含量在12.08～20.12 mg·g-1之間，其中香豆素含量最高的是‘隴中苜蓿’，含量最低的是品種‘清水苜蓿’，‘隴中苜蓿’的含量僅為‘清水苜?！?0.06%，平均含量為16.98 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’、‘隴東’、‘隴中’和‘MF4114’4個(gè)品種高于平均含量，分別較平均含量高了11.00%，0.70%，18.47%和16.27%，‘WL656’、‘新牧4號’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’5個(gè)品種低于平均含量，分別較平均含量低了1.57%，2.21%，6.43%，28.85%和7.39%。‘隴中苜?！南愣顾睾匡@著高于‘WL656’、‘新牧4號’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)，分別高了20.35%，21.15%，26.61%，66.51%和27.92%。

圖1 不同紫花苜蓿品種香豆素含量差異Fig.1 Differences of coumarin content in different alfalfa varieties注：不同小寫字母表示不同品種間差異顯著(P<0.05)，下同Note：Different lowercase letters indicate significant differences between different varieties at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同紫花苜蓿品種的光合生理特性差異

2.2.1不同紫花苜蓿品種的氣體交換參數(shù)差異 由圖2可知，E和Gs值最高的是品種‘隴中苜?！謩e為3.85 mmol·m-2·s-1和103.28 mmol·m-2·s-1，最低的是‘MF4114’，分別為1.40 mmol·m-2·s-1和40.09 mmol·m-2·s-1，‘MF4010’的E和Gs值顯著高于‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘隴東’、‘MF4114’和‘MF4010’(P<0.05)。9個(gè)紫花苜蓿品種E的平均值為2.37 mmol·m-2·s-1，‘新牧4號’、‘隴中’、‘清水’和‘3105c’分別較平均值高了9.08%，11.75%，62.21%和51.67%，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘隴東’、‘MF4114’和‘MF4010’分別較平均值低了30.17%，35.76%，25.64%，40.96%和2.17%；Gs的平均值為67.68 mmol·m-2·s-1，‘新牧4號’、‘隴中’、‘清水’和‘3105c’分別較平均值高了7.98%，26.58%，52.59%和52.55%，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘隴東’、‘MF4114’和‘MF4010’分別較平均值低了29.01%，37.27%，26.12%，40.76%和6.54%。

Pn值最高的是‘MF4114’，為10.94 μmol·m-2·s-1，最低的是‘WL656’，為5.55 μmol·m-2·s-1，‘隴中苜蓿’的Pn值顯著高于‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘新牧4號’、‘隴東’、‘隴中’和‘3105c’(P<0.05)，Pn的平均值為7.51 μmol·m-2·s-1，‘MF4114’、‘MF4010’和‘清水苜?！謩e較平均值高了45.72%，45.28%和3.19%，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘新牧4號’、‘隴東’、‘隴中’和‘3105c’分別較平均值低了25.85%，26.12%，5.65%，24.16%，4.76%和7.65%。

Ci值最高的是‘隴東苜?！?，為612.14 μmol·mol-1，最低的是‘MF4114’，為209.15 μmol·mol-1，‘隴東苜?！c‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘新牧4號’、‘隴中’、‘清水’和‘3105c’差異不顯著，Ci值顯著高于‘MF4114’和‘MF4010’(P<0.05)，‘MF4114’與‘MF4010’差異不顯著，9個(gè)紫花苜蓿品種Ci的平均值為447.11 μmol·mol-1，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘新牧4號’、‘隴東’和‘隴中苜?！謩e較平均值高了15.81%，22.82%，36.21%和0.80%，‘MF4114’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’分別較平均值低了53.22%，45.87%，7.52%和5.93%。

圖2 不同紫花苜蓿品種氣體交換參數(shù)差異Fig.2 Differences of gas exchange parameters among different alfalfa varieties

2.2.2不同紫花苜蓿品種的葉綠素含量差異 由圖3可知，Chla,Chlb和Chl(a+b)含量最高的品種是‘3105c’，分別為1.00 mg·g-1、0.54 mg·g-1和1.59 mg·g-1，Chla和Chl(a+b)含量最低的品種均為‘隴中苜蓿’，分別為0.82 mg·g-1和1.22 mg·g-1，Chlb含量最低的品種是‘清水苜?！?，含量為0.37 mg·g-1?！?105c’的Chlb含量顯著高于‘隴東’、‘隴中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’(P<0.05)，9個(gè)紫花苜蓿品種Chlb的平均含量為0.42 mg·g-1，‘新牧4號’、‘MF4010’和‘3105c’較平均值分別高了8.02%，15.48%和26.37%，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘隴東’、‘隴中’、‘MF4114’和‘清水苜?！謩e較平均值低了3.45%，2.44%，6.77%，13.11%，10.68%和13.42%。

‘隴中苜?！腃hla和Chl(a+b)含量顯著低于‘新牧4號’、‘MF4010’和‘3105c’(P<0.05)，Chla的平均含量為0.90 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’、‘新牧4號’、‘隴東’、‘MF4010’和‘3105c’較平均值分別高了1.63%，4.69%，0.61%，4.94%和11.32%，‘WL656’、‘隴中’、‘MF4114’和‘清水苜?！謩e較平均值低了6.21%，8.98%，4.53%和3.48%；Chl(a+b)平均含量為1.36 mg·g-1，‘新牧4號’、‘MF4010’和‘3105c’較平均值分別高了5.81%，8.48%和16.38%，‘甘農(nóng)9號’、‘WL656’、‘隴東’、‘隴中’、‘MF4114’和‘清水苜蓿’較平均值分別低了0.08%，4.94%，1.87%，10.36%，6.59%和6.82%。

圖3 不同紫花苜蓿品種葉綠素含量差異Fig.3 Differences of chlorophyll content among different alfalfa varieties

2.2.3不同紫花苜蓿品種的光合產(chǎn)物含量差異 由圖4可知，蔗糖含量最高的是‘MF4114’，為9.00 mg·g-1，含量最低的是‘甘農(nóng)9號’，為4.91 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’僅為‘MF4114’的54.53%，‘MF4114’的蔗糖含量顯著高于其他8個(gè)品種(P<0.05)。9個(gè)紫花苜蓿品種蔗糖含量的平均值為6.38 mg·g-1，‘WL656’、‘新牧4號’、‘隴東’和‘MF4114’較平均值分別高了22.63%，9.94%，4.82%和41.15%，‘甘農(nóng)9號’、‘隴中’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’較平均值分低了23.03%，4.14%，14.25%，15.32%和21.80%。

淀粉含量最高的是‘WL656’，為28.07 mg·g-1，含量最低的是‘新牧4號’，為9.09 mg·g-1，‘WL656’的淀粉含量顯著高于其他品種(P<0.05)。淀粉含量的平均值為13.54 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’和‘WL656’較平均值分別高了13.25%和107.28%，‘新牧4號’、‘隴東’、‘隴中’、‘MF4114’、‘MF4010’、‘清水’和‘3105c’較平均值分別低了32.92%，16.98%，14.30%，5.29%，15.34%，19.60%和16.10%。

可溶性糖含量最高的是‘MF4010’，為8.35 mg·g-1，含量最低的是‘3105c’，為6.95 mg·g-1，‘隴東’和‘MF4010’的可溶性糖含量顯著高于‘WL656’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)，‘甘農(nóng)9號’顯著高于‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’(P<0.05)?？扇苄蕴呛康钠骄禐?.62 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’、‘新牧4號’、‘隴東’、‘隴中’和‘MF4010’較平均值分別高了6.23%，2.79%，8.95%，3.58%和9.53%，‘WL656’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’較平均值分別低了5.58%，8.50%，8.21%和8.78%。

可溶性蛋白含量最高的是‘MF4010’，為75.68 mg·g-1，含量最低的是‘隴中苜?！?，為64.13 mg·g-1，‘隴中苜?！目扇苄缘鞍缀匡@著低于‘甘農(nóng)9號’、‘新牧4號’、‘隴東’和‘MF4010’(P<0.05)?？扇苄缘鞍缀康钠骄禐?9.09 mg·g-1，‘甘農(nóng)9號’、‘新牧4號’、‘隴東’和‘MF4010’較平均值分別高了0.61%，1.88%，3.31%和9.53%，‘WL656’、‘隴中’、‘MF4114’、‘清水’和‘3105c’較平均值分別低了0.28%，7.18%，6.25%，1.00%和0.63%。

圖4 不同紫花苜蓿品種光合產(chǎn)物含量差異Fig.4 Differences of photosynthetic product content among different alfalfa varieties

2.3 光合生理指標(biāo)對香豆素含量影響的綜合分析

2.3.19個(gè)紫花苜蓿品種光合生理指標(biāo)及香豆素含量的相關(guān)性分析 供試9個(gè)紫花苜蓿品種的光合生理相關(guān)指標(biāo)及香豆素含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明：香豆素含量與E相關(guān)系數(shù)為-0.675，呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；E與Gs相關(guān)系數(shù)為0.985，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；Pn與Ci相關(guān)系數(shù)為-0.910，呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，香豆素含量與Gs和Ci呈正相關(guān)關(guān)系。Chla含量與Chlb含量和Chl(a+b)含量均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.889和0.969；Chlb含量與Chl(a+b)含量的相關(guān)系數(shù)為0.974，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，香豆素含量與Chla、Chlb和Chl(a+b)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。除此之外，香豆素含量與蔗糖、淀粉和可溶性糖含量呈正相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表1 紫花苜蓿品種光合生理及香豆素含量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of photosynthetic physiology and coumarin content in alfalfa varieties

2.3.29個(gè)紫花苜蓿品種光合生理指標(biāo)與香豆素含量作用的通徑分析 通徑系數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)化的偏回歸系數(shù)，而且消除了各指標(biāo)變異幅度不同造成的影響，能夠客觀地評價(jià)光合指標(biāo)對香豆素含量的影響。故本試驗(yàn)為了探究各光合生理指標(biāo)對香豆素含量的影響大小，對9個(gè)紫花苜蓿品種的香豆素含量和其他11個(gè)光合相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行通徑分析。結(jié)果見表2，通徑分析排除了氣孔導(dǎo)度、葉綠素a和葉綠素(a+b)三個(gè)指標(biāo)對香豆素含量的影響，剩余8個(gè)指標(biāo)根據(jù)直接通徑系數(shù)的絕對值大小可以得出，對香豆素含量的影響程度從大到小依次為：可溶性蛋白(SP)>可溶性糖(SS)>蒸騰速率(E)>葉綠素b(Chlb)>凈光合速率(Pn)>蔗糖(Suc)>胞間CO2濃度(Ci)>淀粉(Sta)。SS和Chlb對香豆素產(chǎn)生較大的正向作用，直接通徑系數(shù)分別為0.681和0.510，其中SS的直接正效應(yīng)最大；E和SP對香豆素產(chǎn)生較大的負(fù)向作用，其中SP對香豆素的直接負(fù)效應(yīng)最大，直接通徑系數(shù)為-1.154。

SS和Chlb均通過SP對香豆素產(chǎn)生較大的間接負(fù)效應(yīng)，間接通徑系數(shù)分別為-0.622和-0.646，且Chlb的負(fù)效應(yīng)最大，但與直接作用相比，Chlb通過SP產(chǎn)生的間接作用大于Chlb的直接作用，SS通過SP產(chǎn)生的間接作用則小于SS的直接作用，說明香豆素主要受Chlb通過SP的間接作用以及SS的直接作用。而Suc和SP分別通過SP和SS對香豆素產(chǎn)生較大的間接正效應(yīng)，間接通徑系數(shù)分別為0.427和0.381，且Suc產(chǎn)生的正效應(yīng)最大，但與直接作用相比，Suc通過SP產(chǎn)生的間接作用大于Suc的直接作用，SP通過SS產(chǎn)生的間接作用則小于SP的直接作用，說明香豆素主要受Suc通過SP的間接作用以及SP的直接作用。其次，本試驗(yàn)8個(gè)光合生理指標(biāo)分別通過其他指標(biāo)產(chǎn)生的間接效應(yīng)從大到小依次為Chlb>SP>Suc>SS>Pn>Sta>Ci>E。綜上所述，SS和SP是影響香豆素含量的主要直接因素，Chlb和Suc通過SP間接影響香豆素含量。

本試驗(yàn)8個(gè)光合生理指標(biāo)的決策系數(shù)從大到小依次為：E>Ci>Sta>Pn>Suc>SS>SP>Chlb，E、Ci和Sta的決策系數(shù)均大于0，其中E的決策系數(shù)最大，為0.455，是香豆素的主要決定因子；Pn,Suc,SS,SP和Chlb的決策系數(shù)均小于0，其中Chlb的決策系數(shù)最小，為-0.503，是香豆素的主要限定因子。

3 討論

3.1 光合生理指標(biāo)與香豆素含量的關(guān)系

香豆素是紫花苜蓿的主要自毒物質(zhì)[28]，其含量的高低受土壤狀況、溫度、水分狀況、苜蓿株齡和自身遺傳特性等因素的影響[29-30]，各因素對香豆素含量的影響都直接反映到生理生化代謝上。近年來，眾多學(xué)者研究各生理生化指標(biāo)(如光合生理相關(guān)指標(biāo))與香豆素等苯丙烷類次生代謝物含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植物的光合作用與苯丙烷類代謝過程具有一定的相關(guān)性[31]。E,Gs,Pn,Ci能夠反映植物光合能力的強(qiáng)弱，葉綠素是植物光合作用光能傳遞、分配和轉(zhuǎn)化過程的重要物質(zhì)[32]，自毒物質(zhì)含量的高低與葉綠素的合成與分解有關(guān)，葉綠素的降解有利于黃酮的合成[15]。自毒物質(zhì)的積累造成PSⅡ反應(yīng)中心和電子傳遞被破壞，植物光合作用進(jìn)程減慢[33]。已有研究表明自毒物質(zhì)肉桂酸的積累會(huì)使植物葉綠素含量、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率下降，胞間CO2濃度顯著上升[34-35]。此外，劉健偉通過測定茶樹在不同氮素條件下黃酮類次級代謝產(chǎn)物含量以及光合作用的變化，發(fā)現(xiàn)隨著氮素的升高葉綠素含量升高，光合作用增強(qiáng)，導(dǎo)致次級代謝物合成受阻，花青素含量下降[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，‘清水苜?！愣顾睾孔畹停]中苜?！愣顾睾孔罡撸銭、Gs和Pn值低于‘清水苜?！?，Ci值則相反，香豆素含量與E呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，Gs與E呈顯著正相關(guān)關(guān)系，Gs的降低引起E和Pn的降低，同時(shí)伴隨著Ci值升高，Pn與Ci呈顯著負(fù)相關(guān)，Chla含量和Chl(a+b)含量均表現(xiàn)出‘隴中苜?！陀凇逅俎！叱曙@著正相關(guān)關(guān)系。與前人研究結(jié)果一致，說明高含量香豆素的合成伴隨著紫花苜蓿光合作用進(jìn)程減慢以及葉綠素合成減少，原因可能是紫花苜蓿香豆素合成過程中存在一定的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，‘隴中苜?！噍^‘清水苜?！e累了更多香豆素，故通過減少葉綠素合成以及降低蒸騰速率等降低自身光合能力來適應(yīng)自毒物質(zhì)香豆素的不斷積累，使植物個(gè)體機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)。

表2 紫花苜蓿品種光合生理與香豆素含量作用的通徑分析Table 2 Path analysis of photosynthetic physiology and coumarin content in alfalfa varieties

蔗糖、淀粉是植物光合作用生成的初級產(chǎn)物，光合初級產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為脂肪和蛋白質(zhì)等初生代謝產(chǎn)物，初生代謝產(chǎn)物通過光合作用和三羧酸循環(huán)等代謝途徑為香豆素等次生代謝物的生成提供能量和一些小分子化合物原料[37]。許多研究表明光合產(chǎn)物與自毒物質(zhì)有密切關(guān)系，劉健偉通過測定春季不同時(shí)期茶樹葉片碳水化合物和黃酮類物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，隨著葉片生長發(fā)育糖類物質(zhì)含量大大降低，同時(shí)黃酮類化合物含量也明顯降低[36]。香豆素類化合物和黃酮一樣都是以碳為基礎(chǔ)的酚酸類次生代謝產(chǎn)物，它們的生物合成需要在充足的糖類供應(yīng)情況下得到加強(qiáng)。糖類也可以作為信號分子，調(diào)節(jié)酚酸類物質(zhì)合成過程中的多種基因表達(dá)[39]。孫天宇通過對不同生育期老山芹香豆素和光合產(chǎn)物含量的測定以及相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)其生育中期光合能力較強(qiáng)，初生代謝活躍，合成較多碳水化合物，促進(jìn)次級代謝物香豆素的積累，香豆素含量的變化與可溶性糖、淀粉呈正相關(guān)關(guān)系[17]。而蛋白質(zhì)與香豆素的合成可能存在兩種關(guān)系，競爭關(guān)系或者當(dāng)前體物質(zhì)含量較高時(shí)，由于競爭同一底物促進(jìn)光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化而含量均提高。本試驗(yàn)中，通過測定9個(gè)紫花苜蓿品種葉片蔗糖、淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白含量，發(fā)現(xiàn)‘隴中苜?！南愣顾?、蔗糖、淀粉和可溶性糖含量均高于‘清水苜?！?，但可溶性蛋白含量低于‘清水苜?！?，且蔗糖、淀粉和可溶性糖與香豆素含量呈正相關(guān)關(guān)系，可溶性蛋白含量與香豆素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與前人研究結(jié)果一致，這說明‘隴中苜?！^高含量的蔗糖、淀粉和可溶性糖與香豆素的積累有密切關(guān)系，作為光合作用初級產(chǎn)物，高含量的蔗糖和淀粉分解產(chǎn)生更多葡萄糖，促進(jìn)糖酵解和磷酸戊糖途徑等初級代謝，為香豆素類化合物的合成提供較多底物和能量，如莽草酸和苯丙氨酸等。而本試驗(yàn)中香豆素含量和可溶性蛋白含量負(fù)相關(guān)的原因可能是苯丙氨酸作為香豆素和蛋白質(zhì)合成的共同底物，出現(xiàn)底物競爭的現(xiàn)象。

3.2 光合生理對香豆素含量影響的綜合討論

香豆素的合成是以莽草酸途徑生成的苯丙氨酸為次生代謝的初始底物[38]，受到光合作用、碳氮代謝、莽草酸途徑以及苯丙烷類代謝等多步生理生化反應(yīng)的調(diào)控，要想選育低香豆素品種，首先必須明確香豆素合成過程中關(guān)鍵物質(zhì)對香豆素含量的影響。簡單相關(guān)性分析雖然能得出光合生理指標(biāo)對香豆素含量的影響程度和性質(zhì)，但不能清楚地反映自變量對因變量的直接和間接作用，從而直接比較各因素的相對重要性，而通徑分析是1921年由美國學(xué)者賴特創(chuàng)立的一種利用通徑系數(shù)分析變量間因果關(guān)系程度的多元統(tǒng)計(jì)分析方法[40]，能夠達(dá)到更全面、準(zhǔn)確分析光合生理指標(biāo)對香豆素含量影響的目標(biāo)。本試驗(yàn)對不同紫花苜蓿品種香豆素含量以及光合生理相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行通徑分析，結(jié)果表明：葉綠素b(Chlb)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和蔗糖(Suc)對香豆素產(chǎn)生較大的直接作用和間接作用。另有研究指出，可溶性糖和可溶性蛋白是影響次生代謝物含量的重要光合生理指標(biāo)[15]，葉綠素含量的高低影響次生代謝產(chǎn)物的含量[17]，本試驗(yàn)與前人的研究結(jié)果一致。SP對香豆素的直接負(fù)效應(yīng)最大，通過SS對香豆素產(chǎn)生的間接正效應(yīng)小于SP的直接效應(yīng)；SS對香豆素直接正效應(yīng)最大，通過其他光合指標(biāo)對香豆素產(chǎn)生的間接作用均小于其直接作用，SS對香豆素的作用程度小于SP。Chlb對香豆素產(chǎn)生的間接負(fù)效應(yīng)最大，通過SP對香豆素產(chǎn)生的間接作用大于Chlb的直接作用，Suc對香豆素產(chǎn)生的間接正效應(yīng)最大，通過SP對香豆素產(chǎn)生的間接作用大于Suc的直接作用?？傮w而言，SP和SS主要通過直接作用影響香豆素含量，Chlb和Suc主要以通過SP產(chǎn)生的間接作用的方式影響香豆素含量。此外，為了得到各個(gè)光合生理指標(biāo)對香豆素含量的綜合決定作用強(qiáng)弱，本試驗(yàn)通過計(jì)算決策系數(shù)將光合生理指標(biāo)對香豆素的綜合作用進(jìn)行排序，結(jié)果表明：蒸騰速率、胞間CO2濃度和淀粉的決策系數(shù)為正值，對香豆素起增強(qiáng)作用，其中蒸騰速率的決策系數(shù)最大，為香豆素的主要決定因子；凈光合速率、葉綠素b、蔗糖、可溶性糖和可溶性蛋白的決策系數(shù)為負(fù)值，對香豆素起限定性作用，其中葉綠素b的決策系數(shù)最小，為香豆素的主要限定因子。

4 結(jié)論

‘隴中苜?！愣顾睾匡@著高于‘清水苜蓿’，較高含量的蔗糖、淀粉和可溶性糖為香豆素的合成提供初始底物，可溶性蛋白與香豆素的合成存在競爭關(guān)系，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系?！]中苜?！€通過減少葉綠素合成以及降低蒸騰速率來適應(yīng)香豆素的積累。此外，可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素b和蔗糖是影響香豆素含量的主要光合生理指標(biāo)，可溶性蛋白和可溶性糖通過直接作用影響香豆素含量，葉綠素b和蔗糖對香豆素含量的影響來自通過可溶性蛋白產(chǎn)生的間接作用。蒸騰速率是香豆素的主要決定因子，葉綠素b是香豆素的主要限定因子。