馬 坤, 趙陽(yáng)安, 周學(xué)麗,2, 王英成, 金 鑫, 張海娟, 顏琿璘, 張卓航, 邱鵬瀅, 蘆光新*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2.青海省草原改良試驗(yàn)站， 青海 共和 813000)

作為陸地生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分之一，青藏高原具有復(fù)雜多樣的微生物群[1]，使得生長(zhǎng)在青藏高原地區(qū)的植物也具有獨(dú)特的生活習(xí)性[2]?！ú?號(hào)’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)極具抗寒抗旱能力，兩種優(yōu)質(zhì)牧草在高寒地區(qū)的引種對(duì)生產(chǎn)發(fā)展和生態(tài)保護(hù)極具意義。由于草地資源的過(guò)分利用，導(dǎo)致青藏高原地區(qū)土壤養(yǎng)分消耗也逐漸增加。施肥是緩解土壤養(yǎng)分匱乏的重要手段之一[3]，近年來(lái)，化肥的大規(guī)模施用給青藏高原地區(qū)帶來(lái)了一系列環(huán)境和生態(tài)問(wèn)題，使草地生產(chǎn)力下降，逐漸不能滿足畜牧業(yè)的需求，限制了畜牧業(yè)發(fā)展[4]。鑒于青海省草地生態(tài)保護(hù)價(jià)值和意義，以及政府對(duì)于化肥農(nóng)藥減量使用政策的實(shí)施，有機(jī)肥替代化肥已成為青海地區(qū)的必然趨勢(shì)。

根際微生物作為土壤微生物重要的組成部分之一[5]，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要功能[6]，是陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量、生產(chǎn)力和可持續(xù)性的敏感指標(biāo)，對(duì)植物養(yǎng)分吸收、抵御逆境等方面具有重要作用[7]，同時(shí)，根際微生物可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，根際微生物通過(guò)取食(侵染)根、或形成共生關(guān)系(如菌根)、或產(chǎn)生植物激素/減少脅迫信號(hào)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，與植物直接互作[8]。作為異養(yǎng)菌，真菌是生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)物分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵參與者，施肥是維持土壤肥力的常用方法之一，已被證明對(duì)土壤真菌群落有很大影響[9]。Yang等[10]基于青藏高原東部和中部的樣帶研究發(fā)現(xiàn)高寒草地土壤真菌多樣性主要受地上植物多樣性和土壤屬性決定，相較于其他土壤微生物類群，真菌對(duì)貧瘠干旱的土壤環(huán)境有著更強(qiáng)的適應(yīng)性。研究證明，與化肥相比，有機(jī)肥對(duì)土壤真菌群落的影響更為顯著，導(dǎo)致真菌多樣性和分類組成發(fā)生更大的變化[11-12]。研究指出，施用有機(jī)肥提供的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)緩解了菌群間的競(jìng)爭(zhēng)，土壤微生物的種類和數(shù)量不僅對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)具有動(dòng)態(tài)性，而且是土壤中植物有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫(kù)，與土壤肥力密切相關(guān)[13]。施用有機(jī)肥對(duì)土壤真菌群落組成的影響主要是通過(guò)改變土壤特性，尤其是土壤碳庫(kù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。有機(jī)肥中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)真菌類群有較大的選擇性，從而增強(qiáng)了生態(tài)位過(guò)濾對(duì)真菌群落的作用，進(jìn)而降低真菌豐富度[15]。

以環(huán)青海湖地區(qū)引進(jìn)種植的兩種禾本科(‘川草2號(hào)’老芒麥、‘阿壩’垂穗披堿草)為研究對(duì)象，通過(guò)田間試驗(yàn)，采用ITS rDNA Illumina高通量測(cè)序技術(shù)，分析研究了施用有機(jī)肥后對(duì)兩種禾本科牧草農(nóng)藝性狀、根際土壤環(huán)境和真菌群落的影響，為有機(jī)肥在高寒地區(qū)的推廣提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

禾本科牧草：由四川省川草生態(tài)科技有限責(zé)任公司提供的‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)和‘川草2號(hào)’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)；有機(jī)肥(有機(jī)質(zhì)含量≥45%，N+P2O5+K2O≥5%，pH值 5.5～8.5)：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院提供技術(shù)配方，主要以富含有機(jī)質(zhì)的農(nóng)作物秸稈和家禽糞便為原料，添加生物發(fā)酵劑加工而成。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于青海省鐵卜加草原改良試驗(yàn)站，地處青海湖西岸，東經(jīng)99°35′，北緯37°05′，海拔3 270 m。該地區(qū)屬高山高原氣候，具有光照充足、日照強(qiáng)烈、冬寒夏涼、降雨集中、干旱少雨、風(fēng)大等氣候特征，在青藏高原具有高寒草地生態(tài)環(huán)境的典型性、代表性。年平均氣溫-0.7℃，最熱月(7月)平均氣溫17.5℃，最冷月(1月)平均氣溫-22.6℃，極端溫度-34.3℃。無(wú)霜期平均為78.7 d，無(wú)絕對(duì)無(wú)霜期。日照時(shí)數(shù)2 670 h，≥0℃年積溫1 331.3℃，年降水量368.11 mm，年蒸發(fā)量1 495.3 mm，相對(duì)濕度58%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年5月進(jìn)行，在青海省草原改良試驗(yàn)站選擇400 m2的地塊作為種植引種兩種牧草的試驗(yàn)區(qū)。試驗(yàn)分為施肥處理和未施肥處理，各重復(fù)6次，共12個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為15 m2(3 m×5 m)，每?jī)蓚€(gè)小區(qū)之間的間距為1 m，播種時(shí)以20 cm 的間隔條播于5 cm深的溝內(nèi)，每個(gè)小區(qū)共播種12行。不施有機(jī)肥的小區(qū)被標(biāo)記為CK，施肥處理的小區(qū)施有機(jī)肥量為7.88 kg。

圖1 試驗(yàn)地小區(qū)分布圖Fig.1 Distribution of test site plots

1.4 樣品采集及測(cè)定方法

1.4.1樣品采集 采樣時(shí)間為2020年9月12日至13日，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽取10株，共120株進(jìn)行標(biāo)記，卷尺測(cè)定根莖基部至離生長(zhǎng)點(diǎn)最近的展開(kāi)葉頂端的絕對(duì)高度為株高。在每個(gè)長(zhǎng)勢(shì)均勻的小區(qū)中，選擇一個(gè)50 cm×50 cm的樣方進(jìn)行采樣，共12個(gè)樣方。選好樣方后，先將地面部分剪掉，然后用小土鏟在垂直的土壤中，挖出30 cm深度的根系，采取“抖根法”抖落植株根系周圍的土壤作為根周土，用刷子刷下根系上粘附的土作為根際土，均質(zhì)化并過(guò)篩(<2 mm)以去除根部和其他植物材料，然后放在冰上運(yùn)輸，土壤樣品分為兩部分，一部分用于確定理化性質(zhì)，另一部分儲(chǔ)存在—80℃用于分子實(shí)驗(yàn)(DNA提取)。將處理好的根系放入裝有一定量水的量筒中，使水完全淹沒(méi)樣品，然后用玻璃棒輕輕攪拌，防止空氣存在，靜置幾分鐘后，測(cè)量溶液的體積，計(jì)算出根系的體積，然后放置樣品。帶回實(shí)驗(yàn)室，放入105℃烘箱中24小時(shí)，冷卻后稱重(地上生物量干重與此方法一致)。

1.4.2土壤理化性質(zhì)測(cè)定 用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定的樣品風(fēng)干、粉碎后，過(guò)0.25 mm孔徑網(wǎng)篩進(jìn)行土壤養(yǎng)分測(cè)定。土壤pH值使用pH計(jì)(pHS-3C)測(cè)定，土壤有機(jī)碳(Soil organic carbon,SOC)用重鉻酸鉀硫酸外加熱法；土壤全氮(Total nitrogen,TN)用半微量凱氏定氮法。

1.4.3土壤微生物測(cè)序及分析 從—80℃的冰箱中取出裝有樣品的無(wú)菌管，在超凈工作臺(tái)中取無(wú)菌管中的土壤10 g，去除植物殘留物和石礫后裝于5 ml的無(wú)菌管中，放于附有冰袋的泡沫箱中寄到中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，采用ITS擴(kuò)增子測(cè)序分析技術(shù)測(cè)定土壤微生物的多樣性及群落結(jié)構(gòu)。采用土壤DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA,美國(guó))操作方法對(duì)所有12個(gè)土壤樣本進(jìn)行DNA的提取。所有樣品濃度和純度使用Nanodrop2000進(jìn)行檢測(cè)，濃度均在20 ng·μL—1以上，A260/A280是1.8～2.0，說(shuō)明土壤樣本DNA濃度及純度較好，可進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。對(duì)24個(gè)土壤樣本進(jìn)行ITS rDNA的基因擴(kuò)增，將所有原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式以及樣本對(duì)應(yīng)的Barcode信息上傳到中科院環(huán)境所鄧曄課題組Galaxy分析平臺(tái)上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)進(jìn)行分析[16]。使用Trim Primer將正反向引物去除。通過(guò)FLASH將正反向序列進(jìn)行拼接，通過(guò)Trim by sequence length對(duì)序列進(jìn)行篩選和修剪，保留長(zhǎng)度在245～260 bp的目的序列。目的序列通過(guò)Unoise方法按97%相似度進(jìn)行OTU歸類，生成原始OTU表，并對(duì)原始表進(jìn)行重抽，使每個(gè)樣品序列數(shù)相同，重抽后的OTU進(jìn)行后期統(tǒng)計(jì)分析[17-18]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究使用Microsoft Excel 2016 和SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。使用單向方差分析(單向分析)和多重比較分析(LSD)，并進(jìn)行最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)以比較5%概率水平的平均值。進(jìn)行了皮爾遜相關(guān)分析和主成分分析。高通量測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制以獲得基因注釋的OTU表。圖中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。并且在完成上述研究?jī)?nèi)容的基礎(chǔ)上，繪制和弦圖(chord Diagram)，是一種顯示矩陣中數(shù)據(jù)間相互關(guān)系的可視化方法，節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)沿圓周徑向排列，節(jié)點(diǎn)之間使用帶權(quán)重(有寬度)的弧線鏈接，節(jié)點(diǎn)權(quán)重決定節(jié)點(diǎn)大小，又決定節(jié)點(diǎn)位置，同時(shí)和弦圖的連線使用源權(quán)重和目標(biāo)權(quán)重控制線寬，粗細(xì)非均勻，而且和弦圖的節(jié)點(diǎn)寬度為連線寬度之和，節(jié)點(diǎn)處的連線平鋪不重疊。采用冗余分析(RDA)、相關(guān)性分析和構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(相關(guān)網(wǎng)絡(luò)根據(jù)隨機(jī)矩陣?yán)碚?RMT)從OTUs構(gòu)建)的方法，研究草地微生物群落組成結(jié)構(gòu)變化及其與環(huán)境相互影響。所有測(cè)序的原始數(shù)據(jù)均于中科院生態(tài)環(huán)境研究中心鄧曄研究員課題組的Galaxy分析平臺(tái)(http://mem.rcees.ac.cn:8080)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種禾本科牧草生物量與莖葉比

如圖2所示，有機(jī)肥的添加顯著影響兩種禾本科牧草的生物量(P<0.05)。‘川草2號(hào)’老芒麥中，有機(jī)肥處理下的地上鮮重、地下鮮重和地下干重均顯著高于CK，施有機(jī)肥后地上鮮重、地下鮮重和干重分別為2 235.13，38.46，21.27 g。阿壩垂穗披堿草中，有機(jī)肥處理下地上鮮重、地下鮮重、地下干重較CK分別增加了205.30，24.67，15.96 g。莖葉比是飼料品質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)之一，葉的比重愈高，牧草品質(zhì)越好,有機(jī)肥降低了兩種牧草的莖葉比，其中，披堿草莖葉比受有機(jī)肥的影響比老芒麥更強(qiáng)(圖2B)。

圖2 A兩種牧草地下生物量，B兩種牧草地上鮮重及莖葉比Fig.2 A. Underground biomass of two pastures. B. Aboveground fresh weight and stem-to-leaf ratio of the two pastures注：CK表示不施肥處理，F(xiàn)表示有機(jī)肥處理。不同小寫(xiě)字母表示老芒麥在不同處理下的顯著差異，不同大寫(xiě)字母表示披堿草在不同處理下的顯著差異。下同Note:CK means no fertilization treatment,F means organic fertilizer treatment. Different lowercase letters indicate significant differences in different treatments of Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2’,and different uppercase letters indicate significant differences in different treatments of Elymus nutans ‘Aba’.The same as below

2.2 土壤理化性質(zhì)

通過(guò)對(duì)阿壩垂穗披堿草和‘川草2號(hào)’老芒麥增施有機(jī)肥的試驗(yàn)，結(jié)果表明：在披堿草中，與對(duì)照相比，有機(jī)肥顯著增加土壤總氮含量，明顯降低土壤pH(P<0.05)；土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著增加0.77%(P<0.05)，表明增施有機(jī)肥后有效緩解土壤堿化，氨氮、硝氮變化不明顯。在老芒麥中，與CK相比，施用有機(jī)肥后土壤有機(jī)碳顯著上升，其他指標(biāo)變化均不顯著。

表1 土壤的基本化學(xué)性質(zhì)Table 1 Basic chemical properties of soils

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)

兩種禾本科牧草根際微生物群落結(jié)構(gòu)如和弦圖(圖3)所示，對(duì)土壤真菌屬水平的分析表明土壤真菌不同屬在不同處理下的分布存在較大的差異，不同處理下的優(yōu)勢(shì)屬也各不相同。赤霉菌屬(Gibberella)、亞隔孢殼屬(Didymella)、裂殼菌屬(Schizothecium)屬為主要優(yōu)勢(shì)屬，平均相對(duì)豐度在 8.0%～16.5%之間；Kotlabase、Preussia、Fusarium屬為次要優(yōu)勢(shì)屬。老芒麥樣地中，增施有機(jī)肥后主要優(yōu)勢(shì)屬與次要優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度皆出現(xiàn)下降；披堿草樣地中，增施有機(jī)肥后Didymella、Schizothecium、Kotlabase屬的相對(duì)豐度下降，而赤霉菌屬(Gibberella)、內(nèi)生真菌(Preussia)、Fusarium屬的相對(duì)豐度上升，其平均相對(duì)豐度分別為17.6%，7.5%，4.4%。

圖3 微生物和弦圖Fig.3 Microbial chord diagram注：(a)‘川草2號(hào)’老芒麥，(b)‘阿壩’垂穗披堿草。物種與樣本關(guān)系的和弦圖，圓圈上邊為物種名，下邊為樣品名，各用不同顏色表示。物種豐度以百分比展示。連線表示某樣本存在某物種，線段越粗，該物種含量越豐富Note:(a) Elymus sibiricus Linn,(b) Elymus nutans ‘Aba’. Chord diagrams of species-sample relationships,with species names at the top of the circles and sample names at the bottom,each indicated by a different color. Species abundance is shown as a percentage. Connecting lines indicate the presence of a species in a sample,and the thicker the line segment,the more abundant the species is

2.4 微生物與環(huán)境因子變量間的相關(guān)性分析

RDA分析結(jié)果顯示(圖4)，在老芒麥中微生物與環(huán)境變量在1，2軸的解釋率分別為23.9%和16.31%，在披堿草中解釋率分別為27.91%和13.88%。兩種牧草中豐度排名前十的屬與環(huán)境因子之間的Spearman分析表明，在老芒麥中，主要優(yōu)勢(shì)屬赤霉菌(Gibberella)與pH、株高、有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中pH對(duì)赤霉菌影響強(qiáng)度最強(qiáng)烈，而與全氮、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；裂殖壺菌(Schizothecium)與pH、銨態(tài)氮及株高呈正相關(guān)，與地下生物量和全氮呈負(fù)相關(guān)；作為子囊菌綱的亞隔孢殼屬(Didymella)與地下生物量、SOC呈顯著正相關(guān)，而與pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)。次要優(yōu)勢(shì)屬內(nèi)生真菌(Preussia)與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮均呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)。在披堿草中，Gibberella、Preussia、Fusicoua都與SOC、地下生物量、株高、TN呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；亞隔孢殼屬(Didymella)、裂殖壺菌(Schizothecium)與pH、硝態(tài)氮呈正相關(guān)，與SOC、株高、地下生物量呈負(fù)相關(guān)。

圖4 RDA分析圖Fig.4 RDA analysis plot注：(a)‘川草2號(hào)’老芒麥，(b)‘阿壩’垂穗披堿草。黑色箭頭表示環(huán)境因子；紅色箭頭表示不同的細(xì)菌類型；箭頭長(zhǎng)度表示環(huán)境變量和微生物之間的相關(guān)性強(qiáng)度。箭頭長(zhǎng)度越長(zhǎng)，相關(guān)性越強(qiáng)。圖中微生物與環(huán)境變量軸之間的垂直距離反映了它們之間的相關(guān)性。距離越小，相關(guān)性越強(qiáng)Note:(a) Elymus sibiricus ‘Chuancao No.2 Linn’,(b) Elymus nutans ‘Aba’. Black arrows indicate environmental factors;red arrows indicate different bacterial types;The arrow length represents the strength of the correlation between the environmental variables and the microbes. The longer the arrow length,the stronger the correlation. The perpendicular distance between microbes and environmental variable axes in the plot reflects their correlations. The smaller the distance,the stronger the correlation

2.5 組內(nèi)網(wǎng)絡(luò)共生關(guān)系

為了進(jìn)一步明確有機(jī)肥的添加對(duì)牧草根際微生物的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)真菌在屬水平進(jìn)行組內(nèi)共生關(guān)系研究，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)見(jiàn)表2。在老芒麥中，與CK相比，有機(jī)肥降低了真菌群落的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)(Total number of nodes)，增加了模塊性，增加主要優(yōu)勢(shì)菌赤霉菌屬與稀有菌群Tetracladium，Nectria，Zymoseptoria，Ilyonectria，Wardomyces，Phaeomycocentrospora，Trichothecium等物種間的相互作用關(guān)系(圖5)，削弱了優(yōu)勢(shì)菌亞隔孢殼屬與其它真菌的共生關(guān)系(圖5)。在披堿草中，與CK相比，有機(jī)肥增加了網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)(Total number of nodes)、模塊性及網(wǎng)絡(luò)密度。披堿草根際微生物間的互作關(guān)系對(duì)有機(jī)肥較敏感，有機(jī)肥的添加增加了稀有菌群間的共生關(guān)系，增強(qiáng)了真菌群落間的聯(lián)系性。

表2 不同處理微生物互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Table 2 Topological properties of microbial interaction networks for different treatments

圖5 網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Network analysis注：A老芒麥在CK處理下根際真菌屬水平下的共生關(guān)系，B老芒麥在有機(jī)肥處理下根際真菌屬水平共生關(guān)系；C披堿草在CK處理下根際真菌屬水平共生關(guān)系，D披堿草在有機(jī)肥處理下根際真菌屬水平共生關(guān)系。節(jié)點(diǎn)根據(jù)模塊化類別著色。連接表示強(qiáng)(r>0.8)和顯著(P<0.01)相關(guān)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小與連接數(shù)成正比Note:A symbiosis of Elymus sibiricus Linn under CK treatment,B symbiosis of Elymus sibiricus Linn under organic fertilizer treatment,C symbiosis of Elymus nutans ‘Aba’ under CK treatment,D symbiosis of Elymus nutans ‘Aba’ under fertilizer treatment Nodes are colored according to the modularity category. Connectivity was strongly (r>0.8) and significantly (p < 0.01) correlated,and the size of each node was proportional to the number of connections

3 討論

3.1 有機(jī)肥對(duì)兩種禾本科牧草生長(zhǎng)及土壤理化性質(zhì)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥可以提高環(huán)青海湖地區(qū)兩種牧草的株高、地上和地下生物量，改變牧草莖葉比，調(diào)整營(yíng)養(yǎng)分配。禾本科牧草對(duì)氮肥敏感，速效氮被植物快速吸收利用，植物高度和植物生物量會(huì)發(fā)生明顯的變化[19]。Elymussibiricus‘Chuancao No2’和Elymusnutans‘Aba’是兩種抗寒抗旱能力極強(qiáng)的牧草，施用有機(jī)肥可以很好地促進(jìn)牧草的生長(zhǎng)，提高營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量[20-21]。土壤物理性質(zhì)是表征土壤肥力大小的重要參數(shù)[22]，有機(jī)肥對(duì)土壤的影響不僅體現(xiàn)在物理性質(zhì)更多還體現(xiàn)在化學(xué)性質(zhì)方面。高宗等[23]發(fā)現(xiàn)單施有機(jī)肥可以顯著增加土壤全氮含量，宋震震等[24]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥可顯著提升土壤微生物氮、有機(jī)碳含量。土壤有機(jī)質(zhì)也是表示土壤化學(xué)肥力高低的重要參數(shù)之一，有機(jī)肥可有效提升和更新土壤有機(jī)質(zhì)，提升土壤酸堿緩沖能力，促進(jìn)土壤微生物生長(zhǎng)繁育[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短期施加有機(jī)肥能增加土壤全氮及有機(jī)碳含量，降低土壤pH,緩解土壤鹽堿化程度。

3.2 兩種牧草真菌群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

為進(jìn)一步明確有機(jī)肥對(duì)高寒地區(qū)土壤真菌群落的影響，本研究在屬水平進(jìn)行群落組成比較，兩種牧草根際真菌在屬水平均具有較高的平均相對(duì)豐度。真菌屬的豐度分析表明，赤霉菌屬(Gibberella)、亞隔孢殼屬(Didymella)、裂殖壺菌屬(Schizothecium)為主要優(yōu)勢(shì)菌，Kotlabase，preussia(內(nèi)生真菌屬)和Fusarium(鐮刀菌屬)為次要優(yōu)勢(shì)菌。兩種牧草真菌群落對(duì)有機(jī)肥的響應(yīng)各不相同，在老芒麥中，有機(jī)肥添加后降低了主要優(yōu)勢(shì)菌與次要優(yōu)勢(shì)菌的平均相對(duì)豐度，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究者在農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，他們田間試驗(yàn)結(jié)果表明，與化肥相比，有機(jī)肥的施用降低了真菌多樣性，主要是通過(guò)促進(jìn)真菌滅絕而非遷移[26]。有機(jī)肥對(duì)真菌群落的選擇性高于化肥，有利于腐生生物的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致土著物種的滅絕，減少物種間的聯(lián)系[27]。真菌群落的變化與土壤性質(zhì)特別是土壤碳資源的變化密切相關(guān)[28]。結(jié)果表明，種的篩選對(duì)真菌群落的組成具有重要意義，施肥主要通過(guò)形成生境的生態(tài)位寬度和養(yǎng)分供應(yīng)來(lái)構(gòu)建土壤真菌群落。在披堿草中，增施有機(jī)肥后，主要優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生明顯變化，赤霉菌屬(Gibberella)相對(duì)豐度顯著上升，亞隔孢殼屬(Didymella)、裂殖壺菌屬(Schizothecium)相對(duì)豐度明顯下降，次要優(yōu)勢(shì)菌preussia(內(nèi)生真菌屬)和Fusarium(鐮刀菌屬)相對(duì)豐度出現(xiàn)上升趨勢(shì)。

有機(jī)肥的應(yīng)用可以導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的變化，從而驅(qū)動(dòng)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[29]。施肥系統(tǒng)下的土壤微生物交換的組成在很大程度上與土壤化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[30]。研究表明，不同生態(tài)系統(tǒng)中的土壤微生物交換是由環(huán)境因素如pH、有機(jī)碳和有效磷決定的[31]，有人提出真菌群落結(jié)構(gòu)與AP，SOM，TN顯著相關(guān)[32]。本試驗(yàn)結(jié)果RDA (圖4) 顯示，在老芒麥中，主要優(yōu)勢(shì)屬赤霉菌(Gibberella)與pH、株高、有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其中pH對(duì)赤霉菌影響強(qiáng)度最強(qiáng)烈。這一結(jié)果進(jìn)一步可以推測(cè)有機(jī)肥通過(guò)降低pH促使Gibberella相對(duì)豐度升高進(jìn)一步促進(jìn)牧草生長(zhǎng)。作為子囊菌綱的亞隔孢殼屬(Didymella)與地下生物量、SOC呈顯著正相關(guān)，可見(jiàn)，Didymella對(duì)于促進(jìn)牧草根系的發(fā)育有一定的積極作用。在披堿草中，Gibberella、Preussia、Fusicoua都與SOC、地下生物量、株高、TN呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；Gibberella、Preussia作為促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益真菌，對(duì)環(huán)境因子變化較為敏感，特別地，有機(jī)肥中富含的SOC和TN對(duì)Gibberella、Preussia的存活提供了正向促進(jìn)作用。土壤真菌群落與pH、SOC、TN等土壤性質(zhì)密切相關(guān)(圖4)，表明施用有機(jī)肥調(diào)節(jié)土壤真菌群落主要是通過(guò)改變生境特征來(lái)實(shí)現(xiàn)的。施用有機(jī)肥直接增加了土壤中的碳庫(kù)(表1)，有機(jī)肥對(duì)真菌類群的選擇性影響較大，導(dǎo)致真菌群落組成成分發(fā)生變化(圖3)，這可能是由于較高的碳輸入量，RDA結(jié)果也顯示SOC與真菌間有顯著的相關(guān)性。

3.3 微生物網(wǎng)絡(luò)共生關(guān)系對(duì)有機(jī)肥的響應(yīng)

除了對(duì)真菌多樣性的影響外，施肥還改變了物種組合。通過(guò)生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)施肥減少了真菌群落中的物種聯(lián)結(jié)，在老芒麥中，表現(xiàn)得更為明顯，有機(jī)肥降低了真菌群落的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)(Total number of nodes)，使真菌群落比對(duì)照更加獨(dú)立，有研究者發(fā)現(xiàn)肥料或有機(jī)肥所引起的養(yǎng)分含量的增加[33]，一般使貧營(yíng)養(yǎng)類群富營(yíng)養(yǎng)化，而使嗜糞類群稀釋[34]。在披堿草中，有機(jī)肥的添加增加了稀有菌群間的聯(lián)系性，值得注意的是，雖然有機(jī)肥增加了披堿草真菌網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)(Total number of nodes)及密度，但主要優(yōu)勢(shì)菌與其他菌群間的聯(lián)系被削弱?？梢?jiàn)，有機(jī)肥對(duì)高寒地區(qū)牧草根際真菌群落網(wǎng)絡(luò)共生關(guān)系因品種差異而影響不同，其中，有機(jī)肥均降低了優(yōu)勢(shì)菌群與其它菌之間的聯(lián)系性，有機(jī)肥料的摻入重新構(gòu)建了土壤真菌群落間的網(wǎng)絡(luò)共生關(guān)系。

4 結(jié)論

高寒地區(qū)施用有機(jī)肥可以促進(jìn)‘川草2號(hào)’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)兩種牧草的生長(zhǎng)，改變莖葉比。有機(jī)肥的添加改變了土壤的基本化學(xué)性質(zhì)，提升了有機(jī)碳儲(chǔ)存量，降低土壤pH。有機(jī)肥處理明顯改變了兩種牧草根際微生物區(qū)系群落結(jié)構(gòu)，降低了老芒麥根際真菌群落的平均相對(duì)豐度，增加披堿草根際赤霉菌屬(Gibberella)、內(nèi)生真菌(Preussia)等有益菌的豐度。有機(jī)肥的應(yīng)用可以導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的變化，其中pH和SOC為驅(qū)動(dòng)的主要環(huán)境因子。施肥降低了優(yōu)勢(shì)物種與其他菌群間的網(wǎng)絡(luò)共生關(guān)系，有機(jī)肥料的摻入重新構(gòu)建了土壤真菌群落間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，緩解了真菌群落間的競(jìng)爭(zhēng)壓力。