何菊，李照偉，陳娟，李瀟，羅元宇，董然然

（1.六盤水水城區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 貴州六盤水 553600；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心 貴陽 550000；3.六盤水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 貴州六盤水 553000；4.盤州市動物疫病預(yù)防控制中心 貴州六盤水 553537；5.貴州大學(xué) 貴陽 550000）

自2018 年8 月我國確診第一例非洲豬瘟疫情以來，非洲豬瘟疫情在我國境內(nèi)蔓延，為實現(xiàn)各級實驗室非洲豬瘟病毒的快速檢測并啟動防控反應(yīng)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部陸續(xù)開展獸醫(yī)實驗室非洲豬瘟病毒檢測資質(zhì)授權(quán)。而實驗室非洲豬瘟病毒檢測的準(zhǔn)確性，對指導(dǎo)基層開展非洲豬瘟疫情防控起到關(guān)鍵性作用，實驗室非洲豬瘟病毒檢測技術(shù)的提升和檢測能力的準(zhǔn)確性是非洲豬瘟疫情能否得到快速控制的重要環(huán)節(jié)。因此，嚴(yán)格管控非洲豬瘟采樣及實驗室檢測的各個環(huán)節(jié)，規(guī)避影響非洲豬瘟病毒檢測結(jié)果，在對非洲豬瘟檢測結(jié)果及時有效的應(yīng)用到疫情防控工作中起到至關(guān)重要的作用。

1 樣品因素

1.1 樣品的采集

1）抗凝血采集和全血時，用含有EDTA 的真空采血管（紫色）或含有3.8%枸櫞酸鈉的注射器抽取血液。采樣部位要充分消毒，避免外源污染的影響。采集抗凝血時，需輕微晃動血液，確保血液與抗凝劑充分混勻，防止因混合不均勻而導(dǎo)致血凝塊的產(chǎn)生。

2）在養(yǎng)殖場或規(guī)模屠宰場自檢時，常使用方便快捷的采集方式，即血拭子。通常采取耳血拭子或尾根血拭子，采集前對采集部位進行消毒，用一次性針頭扎破尖或尾根淺表血管，用醫(yī)用棉簽蘸取適量血樣，將白色棉簽全部染成紅色，每頭豬1 個棉簽，血拭子采集時，確保蘸取足夠的血量，確保病毒的檢出率。采樣結(jié)束按壓止血至血液不再滲出，嚴(yán)防污染其他豬只。

3）非洲豬瘟檢測可使用棉拭子檢測，棉拭子采集時，眼鼻、肛門棉拭子確保采集到分泌物，否則為無效樣品，無法檢出病毒或為低檢出。

4）病死豬或屠宰場宰后胴體抽檢時，采集病死豬組織樣品，主要采集下頜淋巴結(jié)和脾臟組織。采樣時防止腸道等內(nèi)容物污染，取樣時采集病豬病變的組織，胴體采集時，采集組織病變部位的中部，確保樣品采集量適中。采樣后放入樣品保存管或保存袋中，標(biāo)記后密封保存。

1.2 樣品的保存與運輸

1）血液樣品的保存與運輸。抗凝血樣品采集后，在抗凝劑與血液充分混勻的前提下，冷藏保存，防止暴曬。蘸取淺表血之后，將血拭子放入含有適量PBS 或生理鹽水的無菌試管中，冷藏保存；血樣采集管需正向靜置后，在采集樣品12h 內(nèi)送至實驗室檢測，樣品若置于常溫或超出12h 后進行檢測，則會降低病毒含量，影響檢測結(jié)果。

2）棉拭子保存與運輸。棉拭子采集后，放入含有適量PBS 或生理鹽水的無菌試管中，嚴(yán)禁常溫干燥放置采集的棉拭子，或?qū)⒚奘米臃胖糜诓恍l(wèi)生的容器中，導(dǎo)致棉拭子污染或干燥。采樣后12h 內(nèi)送至實驗室檢測或冷凍保存待檢。

3）組織樣品保存與運輸。采集組織樣品后，對樣品進行分類放置，嚴(yán)格放置于組織保存管或密封袋內(nèi)，冷藏保存，于采樣后2～6h內(nèi)冷藏送至實驗室檢測或冷凍保存待檢。

2 實驗環(huán)境及儀器設(shè)備耗材因素

2.1 實驗環(huán)境

病毒檢測實驗室為相對獨立的區(qū)域，病毒實驗室建有屏障或緩沖區(qū)，確保實現(xiàn)相對封閉的環(huán)境。根據(jù)PCR 檢測的要求，實驗室內(nèi)環(huán)境確保通風(fēng)良好，濕度60%～70%之間，溫度24～26℃，配備空調(diào)，減少溫濕度對實驗結(jié)果的影響。實驗室要進行嚴(yán)格區(qū)域劃分，確保各功能區(qū)有效分離。結(jié)合實驗室布局，可根據(jù)操作先后順序，大致分隔為實驗準(zhǔn)備、核酸提取、擴增分析3 個區(qū)域，確保凈污分離，實驗物品遵循單向流動，每次實驗后使用過的儀器設(shè)備要及時進行消毒，且無害化處理廢棄物，防止氣溶膠的產(chǎn)生。

分區(qū)后注明各工作區(qū)域的名稱，在對應(yīng)區(qū)域中合理放置所需的儀器耗材，物資配備齊全。若分區(qū)不合理，則會導(dǎo)致樣品處置過程產(chǎn)生交叉污染，從而影響實驗的準(zhǔn)確性。定期對實驗室使用的儀器設(shè)備取樣檢測，若為陽性，需進行徹底消毒，并間隔一個潛伏期后復(fù)檢為陰性方可繼續(xù)使用。

2.2 儀器設(shè)備耗材

非洲豬瘟病毒檢測實驗室必須配備檢測靈敏度相對較高且與檢測相適應(yīng)的儀器設(shè)備，各分區(qū)物資配備合理，如實驗準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)擺放冰箱、水浴鍋、組織研磨儀、水槽、通風(fēng)櫥等。核酸提取區(qū)應(yīng)配置生物安全柜、核酸提取儀、高速冷凍離心機、混均器、微量加樣器等。擴增分析區(qū)配置熒光PCR 儀、電腦、打印機等。此外，各區(qū)域還應(yīng)有帶蓋密封垃圾桶、消毒設(shè)備、工作服及一次性手套、口罩、吸頭、離心管等耗材，各區(qū)域的設(shè)備物品不得交叉使用，各類儀器技術(shù)規(guī)程要達到檢驗項目的要求，重要儀器要制定儀器操作規(guī)程及使用維護記錄等，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進行使用維護，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運行。各類耗材確保在保質(zhì)期使用，保存方法得當(dāng)，避免耗材污染。吸頭、離心管等使用前進行滅菌或者為無酶無菌耗材，各類儀器使用后進行清洗消毒。

3 實驗試劑

3.1 試劑的選擇與保存

為了快速完成非洲豬瘟病毒檢測，目前基層開展非洲豬瘟病毒檢測時主要采用成品試劑盒，包括核酸提取試劑盒和非洲豬瘟核酸擴增試劑盒兩種。在購買試劑盒時，應(yīng)選擇具有非洲豬瘟病毒檢測生產(chǎn)經(jīng)營試劑盒使用資質(zhì)的廠家，已取得農(nóng)村農(nóng)業(yè)部核發(fā)的產(chǎn)品批準(zhǔn)文號的非洲豬瘟病毒診斷制品，并通過正規(guī)途徑購買。為確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可信，盡量使用與各級實驗室相同的診斷試劑，從而減少與上級部門檢測試劑差異因素。

檢測試劑需嚴(yán)格按試劑盒要求保存的溫度條件進行保存，錯誤的保存溫度會嚴(yán)重影響試劑的檢測靈敏度甚至完全失效，導(dǎo)致實驗耗時及資金投入增加。通常核酸提取試劑盒存放于干燥室溫環(huán)境，擴增試劑盒存放于-20℃。擴增試劑盒購入時對擴增檢測試劑進行部分按需分裝，減少試劑反復(fù)凍融而影響試劑的檢測效果。

3.2 試劑的使用

目前常用非洲豬瘟病毒擴增試劑盒主要為兩種，一種是根據(jù)PCR 反應(yīng)體系所需試劑，在計算用量后，結(jié)合使用量分別加入后混合使用的，主要包含水、PCR 反應(yīng)液、引物探針混合液。一種是配合好的A、B 液，兩種混合液全部混合均勻即可?；旌蠒r要進行充分混合，使用微量移液器時要規(guī)范操作，確保各試劑使用量足夠。冷凍試劑使用時要提前進行回溫，確保試劑完全融化。PCR 反應(yīng)體系中酶對溫度敏感，使用時應(yīng)置于冰上操作，用完后及時冷凍保存，按需分裝，減少凍融次數(shù)。確保試劑在有效期內(nèi)使用，做好試劑登記管理。

核酸提取試劑盒分為手動提取和機提試劑盒兩種，手動提取試劑盒操作步驟繁瑣，耗時相對較長，人工操作容易造成核酸提取量不足或核酸受污染等人為因素較大，在基層非洲豬瘟病毒核酸提取時應(yīng)用較少。手動提取試劑盒操作時嚴(yán)格按照操作步驟進行，試劑反應(yīng)時間及離心速度、試劑加入用量充足等，做好標(biāo)記，規(guī)范操作，避免交叉污染，否則均會影響核酸的濃度和純度。機提試劑盒使用時確保樣品加入至提取液面以下，蛋白酶k 的用量充足，并做好標(biāo)記，避免加錯反應(yīng)孔。吸頭不可重復(fù)使用，防止交叉污染。機提試劑盒需與核酸提取儀匹配，方能有效提取核酸。

4 人員因素

4.1 檢測人員的配置

非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測對實驗室操作的要求更為嚴(yán)格，它是以DNA 擴增檢測分子生物學(xué)的檢測技術(shù)，要求取得檢測資質(zhì)的獸醫(yī)實驗室應(yīng)配備2 名以上具有實驗室檢測技術(shù)且掌握簡單英語的人員，以確保實驗的可重復(fù)性。檢測人員應(yīng)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化的實驗室技術(shù)規(guī)范、相關(guān)法律法規(guī)、操作規(guī)程、生物安全防護知識和實際操作技能等培訓(xùn)，并獲得檢測資格后方可開展相關(guān)檢測工作。

4.2 檢測人員技術(shù)要求

進行非洲豬瘟病毒檢測的人員，不僅要具備強烈的責(zé)任心，耐心細(xì)致的進行實驗操作，具有嚴(yán)謹(jǐn)對待科學(xué)實驗的態(tài)度，還需熟知實驗原理，熟練操作相關(guān)設(shè)備，規(guī)范使用儀器，熟悉檢測步驟和方法，明確工作流程，掌握實驗質(zhì)量控制方法、檢測結(jié)果分析及生物安全防護措施。在出現(xiàn)錯誤時具有分析查找原因的能力。在實驗操作過程中，嚴(yán)格按照實驗程序，高度集中精神，防止加錯樣品或跳孔現(xiàn)象的發(fā)生，正確使用移液器，使用前檢查移液器量程，吸取液體時觀察吸頭液體的吸取量和是否取到液體。實驗室人員要參與相關(guān)部門的盲樣比對考核，合格后方可上崗。定期進行實驗室技能培訓(xùn)，查缺補漏，提高實驗室各項技能，確?？茖W(xué)規(guī)范的檢測流程，準(zhǔn)確可靠的檢測數(shù)據(jù)。

5 討論

經(jīng)過以上分析，非洲豬瘟病毒檢測從采樣至實驗室檢測操作中的每一個環(huán)節(jié)，都會不同程度的對其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因此，在檢測失敗時，認(rèn)真分析查找影響因素對非洲豬瘟病毒檢測的準(zhǔn)確性起到關(guān)鍵性作用。在基層實踐操作中，需要工作人員認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶Υ僮髦械母鱾€環(huán)節(jié)，不斷積累和總結(jié)經(jīng)驗、查找問題等能力也是提高非洲豬瘟病毒檢測準(zhǔn)確性的必備技能還需配備與檢測要求相符合的實驗條件，盡可能的認(rèn)識和排除影響實驗結(jié)果的風(fēng)險因素。合進而逐一避免，使非洲豬瘟檢測及時發(fā)揮預(yù)警預(yù)報作用，從而指導(dǎo)非洲豬瘟防控工作。