孔維凱，吉佳樂，郭海濤，何志承

肺炎是由細菌、病毒、衣原體和支原體等微生物引起的感染性疾病，在普通人群中存在較高的發(fā)病率，并可由于誤診、治療不及時等原因?qū)е禄颊咚劳觥Ｄ壳?，臨床肺炎的病理診斷和研究主要采用傳統(tǒng)病理切片方法，存在取材部位較為局限的缺點。大組織切片技術(shù)可以將肺組織水平切面完整地展現(xiàn)在一張切片上，有利于對肺部炎癥的發(fā)生部位及周圍微環(huán)境進行全面觀察與評估，并可將相關(guān)技術(shù)應用到肺部腫瘤的臨床診斷和研究中[1]。本研究從固定、取材、脫水、包埋、切片、染色等過程就肺大組織切片的制作方法及注意事項進行梳理，為其在臨床診斷及科學研究中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集2020年3～6月陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院生物樣本庫存檔的3例新型冠狀病毒肺炎尸檢肺組織大體標本。

1.2 試劑及儀器(1)Gill改良蘇木精染液；(2)乙醇性伊紅液；(3)1%鹽酸乙醇分化液；(4)10%中性福爾馬林；(5)無水乙醇；(6)二甲苯；(7)Sasol病理石蠟54～56 ℃/56～60 ℃；(8)中性樹膠；(9)德國Leica-SM2010R平推式切片機；(10)德國Leica-HistoCore Arcadia H/C包埋機；(11)德國Leica-ST5010自動染色機；(12)德國Leica-ASP300S全自動脫水機；(13)美國Thermo fisher移液器F1-ClipTip 30～200 μL；(14)德國Leica-819一次性窄型刀片；(15)KF-PRO-005-EX數(shù)字切片掃描儀。

1.3 方法

1.3.1固定 組織離體后盡快浸入10%中性福爾馬林中，防止細胞自溶。條件允許情況下可從氣管灌注固定液固定，避免肺部殘留的空氣無法排除，造成固定不徹底，影響后期制片。

1.3.2取材 (1)將固定24 h后的完整肺組織由尖部至底部沿垂直肺葉最大徑方向行水平橫斷面切開(圖1)，要求大小適中，切面平整，并依次編號。取材時要注意保持組織病變處的特征和器官的完整性，避免用力擠壓，以防組織因受外力而變形。取材時使用的刀剪應保持鋒利，取材厚度0.4～0.7 cm，要求所取組織塊厚薄一致、形態(tài)規(guī)整、切面平整。若組織塊太厚，會導致脫水不完全、透明不徹底；若組織塊太薄，又易使脫水后的組織變形、邊緣卷曲加重，造成切片不完整[2]；(2)將組織依次放入脫水塑料包埋盒中并編號，注意將切面向上后進行大體拍照；(3)將包埋盒轉(zhuǎn)移至脫水框。

圖1 完整肺組織按橫斷面切開：橫徑3～11 cm，縱徑0.8～3 cm，厚0.4～0.7 cm

1.3.3組織處理 組織固定、脫水、透明、浸蠟步驟均在德國Leica-ASP300全自動脫水機中完成，脫水程序見表1。由于肺大組織體積較大，相對常規(guī)標本處理時間有所延長，處理時間不足會導致組織內(nèi)部水分殘留，切片易碎有空洞。同時應注意控制二甲苯的透明時間及溫度，防止透明過度導致組織變硬變脆。選用54～56 ℃石蠟，并打開脫水機正負壓交替功能，有助于排出肺組織中空氣，使肺泡及支氣管內(nèi)部充分浸蠟。

表1 Leica-ASP300S脫水機脫水程序設置

1.3.4組織包埋 (1)包埋前將組織浸于56～60 ℃石蠟中預熱，防止由于組織溫度過低與包埋石蠟分離，避免切片中出現(xiàn)裂隙；同時使用鑷子輕壓肺組織，排出支氣管及肺泡中的空氣，使石蠟充分填充肺組織標本。(2)先在包埋模具底部加一層與組織厚度相同的石蠟，迅速將組織從包埋盒轉(zhuǎn)移至包埋模具中，注意將需要觀察的面朝下放置于靠近包埋模具的一端，預留空白區(qū)，方便切片中使用鑷子夾取蠟帶而不損傷組織；用包埋機配套的金屬壓錘將組織壓平整，貼合包埋模具底部；最后將包埋模具加滿液體石蠟；(3)模具加滿石蠟后放置于包埋機冷臺降溫，模具中蠟塊表面凝固后轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱中繼續(xù)降溫，注意控制冷凍時間，防止冷凍過度導致蠟塊出現(xiàn)開裂分層，影響后期制片；(4)待石蠟完全凝固后從模具中取出蠟塊，將蠟塊四周修理平整，以便切片機夾頭穩(wěn)定夾持蠟塊。

1.3.4切片 將德國Leica-SM2010R平推式切片機放置于穩(wěn)定水平的桌面，設置刀片與石蠟面角度5°，刀架傾斜角度45°，切片厚度3.5 μm。由于大組織蠟塊在切片過程中刀片阻力較大，蠟塊需進行預冷處理。切片過程中應注意：(1)保持蠟塊面與切面水平；(2)粗修蠟塊至最大面，進刀不宜過快，粗修手輪每次旋轉(zhuǎn)不應超過60°，粗修進刀過快，刀架會擠壓蠟塊，蠟塊形變會導致切片厚薄不均；(3)初修蠟塊后更換新刀片，以緩慢勻速方式進行切片，厚度3.5 μm。

1.3.5漂片、裱片、烤片 用眼科鑷展開切片褶皺，調(diào)節(jié)水溫至55 ℃，組織石蠟切片自然展開，切片趨于平整后，用專用大組織載玻片將組織裱在玻片中央。使用設定為70 ℃鼓風烤箱烤片20～30 min。

1.3.6HE染色 肺大組織切片染色方法與病理科常規(guī)HE染色方法相同，使用德國Leica-ST5010自動染色機進行染色。由于大組織載玻片規(guī)格與自動染色機染色架規(guī)格不同，故采用斜對角線插片法放置載玻片(圖2)。自動染色機染色注意做好HE染色質(zhì)量控制，在染色前預染質(zhì)控片，試驗合格后方可進行后續(xù)染色。

圖2 肺大組織切片在染色架中的放置

1.3.7封片 封片時應注意封片樹膠必須完整覆蓋組織，保證蓋玻片四周不溢膠，鏡下無氣泡。為提高封片質(zhì)量，可使用移液器吸取150 μL中性樹膠，轉(zhuǎn)移至載玻片，中性樹膠呈類圓形分布于載玻片中央，用蓋玻片一側(cè)接觸載玻片，緩慢放下，可避免氣泡產(chǎn)生。將封好的玻片放置于通風處晾干后觀察。

2 結(jié)果

2.1 HE染色鏡下見組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞輪廓明確，核質(zhì)對比分明?？梢姺闻萆掀ど栽錾?，肺泡腔內(nèi)可見分泌物及出血，肺泡間隔增寬，纖維組織增生并見少量中性粒細胞浸潤(圖3)。

圖3 肺大組織切片HE染色

2.2 組織對比使用數(shù)字切片掃描儀對HE切片進行全玻片掃描，并對同一水平面的切片進行拼接，得到完整的肺大組織水平橫斷面HE切片(圖4A)。拼接后的大組織切片與大體取材時的肺組織形態(tài)較為吻合(圖4B)。此外，通過調(diào)取該例患者CT影像資料，并進行對比，發(fā)現(xiàn)拼接后的大組織切片也能較好地還原影像學表現(xiàn)(圖4C)。

圖4 A.肺大組織切片拼接圖；B.肺大組織切片對應的大體圖像；C.肺大組織切片對應的CT影像

3 討論

大組織切片技術(shù)在病理診斷及科學研究中具有其獨特的優(yōu)勢，標準的制作流程有利于病理醫(yī)師和研究者觀察組織的形態(tài)與結(jié)果。在操作過程中需注意以下幾個環(huán)節(jié)：(1)組織脫水時使用梯度乙醇，防止因脫水試劑穿透效果差造成組織內(nèi)部脫水效果不佳；控制二甲苯溫度，室溫即可，高于30 ℃容易增加組織脆性，增加切片難度[2]；(2)包埋時需將包埋面按壓平整，防止切片不完整；(3)切片前需對切片機進行檢查，包括切片機是否水平放置，切片機各部件螺絲是否鎖緊，以及在切片過程中隨時通過觀察切片厚薄，判斷切片機內(nèi)部齒輪是否咬合緊密，進刀精度是否精確；(4)肺實質(zhì)中含有支氣管及大量肺泡，切片粗修過程中蠟塊切面會產(chǎn)生細微的刀痕，需用一張刀片將蠟塊表面細修光滑后再用新刀片完成切片，提高切片質(zhì)量；(5)漂片時注意控制水溫，減少漂片產(chǎn)生的褶皺及氣泡；(6)烤片時溫度應適宜，溫度過低會有石蠟殘留，出現(xiàn)染色不均的現(xiàn)象；溫度過高、時間過長會導致組織收縮，邊緣卷曲；(7)二甲苯透明后立即封片，把控好中性樹膠黏稠度，使用微量移液器滴膠封片，防止封片溢膠、氣泡、封片不完整。此外，組織大切片技術(shù)的開展有助于全面地觀察病變區(qū)域的全貌及其毗鄰關(guān)系、周圍微環(huán)境等，從而加深對疾病及其背景的認識。病理大切片技術(shù)聯(lián)合數(shù)字病理圖像掃描可以更好地對患者的病變進行分析，助力精準醫(yī)學，提升預測患者預后的準確性，并為更精確的個性化治療方案制定提供依據(jù)[1]。

綜上所述，基于大切片技術(shù)的病理組學、影像組學及分子結(jié)構(gòu)特征相融合的臨床診療數(shù)據(jù)將在臨床診治和科學研究中發(fā)揮更加重要的作用。