蔡小波，王小佩，曹學(xué)全，楊朝暉

乳腺癌是影響女性健康的常見疾病[1]，隨著乳腺癌診療水平的提高，患者生存期明顯提高，但一些特殊類型亞型如三陰型乳腺癌(triple-negtive breast cancer, TNBC)，預(yù)后不佳[2]。腫瘤免疫治療已成為惡性腫瘤治療的重要手段之一[3]。PD-1藥物在TNBC治療中展現(xiàn)了積極的治療效果[4-5]。但PD-1/PD-L1在TNBC患者中的陽性率低，約20%[6]。因此，探索新的免疫逃逸通路及調(diào)控路徑，有望增強免疫治療在TNBC治療中的效果。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1/LAG-3是另一條腫瘤免疫逃逸通路[7]，阻斷該通路可刺激腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的活化和增殖來提高機體對腫瘤的免疫與清除。Galectin-9/Tim-3通路能增加效應(yīng)性T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能[8]。然而，上述通路在TNBC中的研究報道較少，因此，檢測TNBC中Galectin-9和FGL1的表達(dá)情況，有助于為TNBC的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月～2019年12月臺州市中心醫(yī)院(臺州學(xué)院附屬醫(yī)院)行手術(shù)治療的108例TNBC患者，同時選取108例非TNBC患者作為對照。以上患者臨床資料均完整，符合入組標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫TIMER檢索Galectin-9、FGL1在乳腺癌中的表達(dá)及免疫浸潤狀態(tài)。收集上述標(biāo)本，提取組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后熒光定量PCR檢測Galectin-9、FGL1的mRNA表達(dá)水平。免疫組化染色采用EnVision法，經(jīng)BENCHMARK平臺(Roche公司)檢測Galectin-9和FGL1的蛋白表達(dá)水平?？贵wGalectin-9購自Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)GL1購自Abcam公司，二抗及顯色試劑購自Roche公司。Galectin-9和FGL1陽性結(jié)果判讀參照文獻(xiàn)[9-10]。免疫組化結(jié)果經(jīng)兩位病理醫(yī)師獨立閱片和診斷，綜合判定結(jié)果。收集上述患者的臨床資料，分析Galectin-9、FGL1表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。

1.3 觀察指標(biāo)(1)觀察Galectin-9、FGL1在免疫浸潤中的調(diào)節(jié)模式；(2)對比各組Galectin-9、FGL1 mRNA和蛋白的表達(dá)差異情況；(3)觀察Galectin-9、FGL1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析TCGA數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示，Galectin-9(圖1A)和FGL1(圖1B)在乳腺癌中均呈高表達(dá)。Galectin-9表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)，F(xiàn)GL1表達(dá)與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)(圖2)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的表達(dá)水平

圖2 乳腺癌中Galectin-9(A)和FGL1(B)的免疫浸潤水平

2.2 TNBC組織和非TNBC組織中Galectin-9、FGL1的表達(dá)TNBC組中Galectin-9、FGL1 mRNA陽性率分別為55.55%和26.85%，與正常組織相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，非TNBC組中Galectin-9、FGL1 mRNA陽性率分別為47.22%和12.96%，與正常組織相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

TNBC組Galectin-9在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中的陽性率分別為50.93%、52.78%；FGL1在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中的陽性率分別為27.78%、30.56%。非TNBC組Galectin-9在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中的陽性率分別為39.81%、38.89%，F(xiàn)GL1在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中的陽性率分別為14.81%、13.89%。TNBC組相對非TNBC組Galectin-9、FGL1表達(dá)水平更高(表1，圖3)。

圖3 A.Galectin-9在正常乳腺組織中的表達(dá)，EnVision法；B.Galectin-9在TNBC中的表達(dá)，EnVision法；C.Galectin-9在非TNBC中的表達(dá)，EnVision法；D.FGL1在正常乳腺組織中的表達(dá)，EnVision法；E.FGL1在TNBC中的表達(dá)，EnVision法；F.FGL1在非TNBC中的表達(dá)，EnVision法

表1 TNBC組織和非TNBC組織中Galectin-9、FGL1蛋白的表達(dá)[n(%)]

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TNBC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中Galectin-9表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑和腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05)，與組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；TNBC腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中FGL1表達(dá)與患者年齡和腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05，表2)。

表2 TNBC中Galectin-9及FGL1在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)TIL中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

在組織學(xué)類型中，統(tǒng)計標(biāo)本有浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌三種類型，在非TNBC組中，Galectin-9和FGL1表達(dá)與組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)，且各組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表3)。Galectin-9和FGL1在TNBC浸潤性導(dǎo)管癌和非TNBC浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表3 Galectin-9及FGL1在非TNBC不同組織學(xué)類型中的表達(dá)

表4 Galectin-9及FGL1在TNBC和非TNBC不同組織學(xué)類型中的表達(dá)

3 討論

乳腺癌中TNBC占乳腺癌腫瘤的10%～20%，因其缺乏明確的靶向治療位點，進(jìn)而影響患者的生存期[11]。隨著乳腺癌精準(zhǔn)治療和分子分型的研究推進(jìn)，目前認(rèn)為TNBC可以分為4個亞型，分別為免疫調(diào)節(jié)型(mmunomodulatory, IM)、腔面雄激素受體型(luminal androgen receptor, LAR)、基底樣免疫抑制型(basal-like immune-suppressed, BLIS)和間質(zhì)型(mesenchymal, MES)，其中IM亞型間質(zhì)TIL顯著增多，具有高免疫原性特性，具有腫瘤免疫治療的應(yīng)用前景，并且能夠?qū)δ[瘤免疫有效應(yīng)答[12]。

腫瘤免疫治療是TNBC的一個突破口，近年來，通過阻斷PD-1/PD-L1通路來調(diào)節(jié)機體免疫狀態(tài)，抑制免疫逃逸的“免疫正?；盵13]治療策略，已經(jīng)成功的在非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤等疾病中開展臨床治療。針對TNBC的PD-1/PD-L1研究和聯(lián)合治療等策略[14]，已經(jīng)有多項策略在臨床試驗中開展，并獲得積極進(jìn)展。PD-1/PD-L1在TNBC中存在陽性率低，部分陽性患者應(yīng)答效率低等問題，因此針對陰性患者尋找新的免疫抑制逃逸通路和對于應(yīng)答效率低的陽性患者尋找具有協(xié)同作用的免疫通路，值得進(jìn)一步研究。

Tim-3是一類T細(xì)胞表面抑制性分子，能夠引起T細(xì)胞衰竭，其中一個配體為Galectin-9[15]。Tim-3在腫瘤T細(xì)胞的損耗中起關(guān)鍵作用。協(xié)同抑制PD-1/PD-L1和Tim-3/Galectin-9通路能夠較好的糾正T細(xì)胞的耗竭狀態(tài)，并能夠增加效應(yīng)性T細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能，且Tim-3與抗PD-1治療的藥物耐藥緊密相關(guān)[16]，提示Galectin-9可以作為和PD-L1的有效協(xié)同靶點。FGL1/LAG-3是目前新發(fā)現(xiàn)的另一條腫瘤免疫逃逸通路[17]，阻斷該通路能夠刺激腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的活化和增殖[18]。LAG-3是一個在活化T細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白[19]。LAG-3主要功能為作為受體傳遞抑制性信號[20]。FGL1是LAG3的一個功能性配體。FGL1表達(dá)上調(diào)與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后不佳相關(guān)，在胃癌[21]和肝癌[22]中均見相關(guān)報道。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)GL1在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中起重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL1/LAG-3相互作用是獨立于PD-1/PD-L1通路的另一條腫瘤免疫逃逸通路。FGL1/LAG-3有望成為TNBC中繼PD-1/PD-L1后的另一個治療靶點。

目前臨床研究主要集中于FGL1和Galectin-9的受體LAG-3和Tim-3，當(dāng)前針對LAG-3和Tim-3靶點的藥物尚未上市，但相應(yīng)涉及黑色素瘤、血液腫瘤和實體瘤等臨床研究，分別有臨床Ⅰ～Ⅲ期不同階段的研究開展。BMS公司[23]和默沙東公司[24-25]的LAG-3抗體在各種實體瘤中開展臨床研究，有部分已經(jīng)展示了治療潛力。Tim-3抗體目前已在肺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多項實體瘤中展開研究，Cobolimab為全球開發(fā)階段最高的Tim-3抗體，與PD-1抗體聯(lián)用可明顯抑制腫瘤發(fā)展[26]。相比于PD-1/PD-L1，以LAG-3和Tim-3為靶點的藥物開發(fā)尚屬早期，但均展現(xiàn)了客觀的治療效果，因此其受體在腫瘤中表達(dá)情況的研究，尤其是在TNBC等報道較少領(lǐng)域的研究，有助于推進(jìn)FGL1/LAG-3和Galectin-9/Tim-3靶點藥物的研究。

本實驗中，Galectin-9和FGL1在TNBC中顯著高表達(dá)，其mRNA和蛋白水平陽性率分別為55.55%、50.93%和26.85%、27.78%，在間質(zhì)TIL中同樣具有相同趨勢的表達(dá)[27]。與臨床病理相關(guān)指標(biāo)研究表明，其與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在相關(guān)性，提示Galectin-9和FGL1可能是TNBC的有效靶點之一。經(jīng)TIMER數(shù)據(jù)庫[28]檢索腫瘤組織中的6種免疫細(xì)胞的浸潤情況[29]表明，Galectin-9與FGL1的免疫浸潤模式存在不同，這或許與Galectin-9和FGL1與PD-L1的表達(dá)模式不同存在相關(guān)性，值得后續(xù)進(jìn)一步探究。而在組織學(xué)類型中，Galectin-9和FGL1在TNBC和非TNBC浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但由于浸潤性小葉癌和浸潤性微乳頭癌病例數(shù)限制，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，在分子及蛋白表達(dá)水平上，TNBC組與非TNBC組均高表達(dá)Galectin-9與FGL1，提示針對TNBC的治療具有潛在的前景，有可能在TNBC的免疫治療中產(chǎn)生積極的效果，相關(guān)后續(xù)研究深入探究其相互作用，并深入分析各TNBC亞型中Galectin-9與FGL1的表達(dá)情況，有望對TNBC患者的免疫治療產(chǎn)生積極作用。