張亞楠，劉杭豐，鄭錦秀,3，郗彥鳳，楊 濤,3

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾是真核生物最普遍的RNA修飾方式。YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1(YTH N6-methyladenosine RNA-binding protein 1, YTHDF1)是m6A結(jié)合蛋白，在識別和結(jié)合m6A修飾轉(zhuǎn)錄本方面發(fā)揮作用[1]。近年來，文獻(xiàn)報道YTHDF1在肝癌[2]、卵巢癌[3]和子宮頸癌[4]等多種癌癥中廣泛上調(diào)，并在胃癌[5]中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲的作用。然而，YTHDF1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)以及對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目前尚不明確。

此外，YTHDF1還與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)中免疫細(xì)胞浸潤水平有關(guān)[6]。在肺腺癌中，YTHDF1表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤水平具有相關(guān)性[7-8]；YTHDF1高表達(dá)與肝細(xì)胞癌中低CD8+T細(xì)胞浸潤有關(guān)[9]；YTHDF1拷貝數(shù)增加導(dǎo)致胰腺癌中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤水平降低[10]。Yan等[11]通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1與結(jié)直腸癌組織中免疫細(xì)胞浸潤具有相關(guān)性，但尚未在臨床樣本中驗證。本研究首次采用免疫組化法檢測YTHDF1的表達(dá)及其與結(jié)直腸癌中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，旨在為結(jié)直腸癌免疫治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620、HCT116等均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。收集2015年3月～2015年6月山西省腫瘤醫(yī)院手術(shù)后制備的結(jié)直腸癌及癌旁石蠟包埋組織53對，并制備組織芯片。McCoy′s 5A培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Moregate Biotech公司；CCK-8試劑盒購自Boster公司；Transwell小室購自康寧公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；YTHDF1(ab220162)購自Abcam公司；YTHDF1抗體(17479-1-AP)購自Proteintech公司；CD4(ab133616)和Foxp3(ab215206)均購自Abcam公司；CD8(70306s)購自Cell Signaling Technology公司；通用型試劑盒(小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng))、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載結(jié)直腸癌患者mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息。經(jīng)處理后，共篩選568例結(jié)直腸癌及44例正常結(jié)直腸樣本，其中473例包含臨床信息。

單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)用于分析結(jié)直腸癌樣本中23種免疫細(xì)胞浸潤情況。

1.2.2免疫組化 制作帶有陣列孔的受體蠟塊，根據(jù)HE染色制備成組織芯片蠟塊。將切片脫蠟至水，枸櫞酸鈉高壓修復(fù)，阻斷劑消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，5%BSA封閉，加一抗YTHDF1(1∶100)、CD4(1∶500)、CD8(1∶200)、Foxp3(1∶250)4 ℃過夜，PBS水洗后加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固[12]。YTHDF1、CD4、CD8結(jié)果判讀：(1)按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；(2)按細(xì)胞著色強(qiáng)度評分，無著色為0分，淡黃色或淡黑色為1分，棕黃色或棕黑色為2分，棕褐色或黑色為3分。將兩項評分乘積作為總評分：>4.5分為高表達(dá)組，≤4.5分為低表達(dá)組[13]。Foxp3結(jié)果判讀：隨機(jī)選擇3個40倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)求平均值[14]。所有免疫組化染色結(jié)果均由兩名病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評分。

1.2.3質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計YTHDF1 shRNA引物，shRNA-1上游引物：GATCCCGAAAGAGTTTGAGTG GAACTCGAGTTCCACTCAAACTCTTTCGTTTTTG，下游引物：AATTCAAAAACGAAAGAGTTTGAGTGGAA CTCGAGTTCCACTCAAACTCTTTCGG；shRNA-2上游引物：GATCCGATACAGTTCATGACAATGACTCGAG TCATTGTCATGAACTGTATCTTTTTG，下游引物：AATTCAAAAAGATACAGTTCATGACAATGACTCGA GTCATTGTCATGAACTGTATCG；shRNA-3上游引物：GATCCGAAACGTCCAGCCTAATTCTCTCGAGAG AATTAGGCTGGACGTTTCTTTTTG，下游引物：AATT CAAAAAGAAACGTCCAGCCTAATTCTCTCGAGAGAA TTAGGCTGGACGTTTCG。引物退火形成雙鏈，用BamHⅠ、EcoRⅠ對載體37 ℃雙酶切，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化。挑單克隆，37 ℃搖菌12～14 h后送測序。

1.2.4Western blot 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，次日二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，凝膠成像儀顯影。

1.2.5CCK-8和平板克隆實驗檢測細(xì)胞增殖 按5×103個/孔細(xì)胞接種至96孔板中，分別培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，1～2 h后檢測450 nm處的吸光度值。

按2×103個/孔細(xì)胞接種至6孔板中，培養(yǎng)14天，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，計算克隆形成數(shù)量。

1.2.6劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移 細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，待細(xì)胞完全匯合后用200 μL槍頭在孔板內(nèi)行“井”字劃痕，分別于0、24、48 h時在相同位置拍照，并用Image J軟件分析。

消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室；下室加入750 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育箱中培養(yǎng)48 h后，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，隨機(jī)選取3個視野，光鏡下計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有圖表用GraphPad Prism、Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。Wilcoxon秩和檢驗用于評估箱線圖的統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，YTHDF1與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，計數(shù)資料分析采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YTHDF1在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中YTHDF1 mRNA的表達(dá)水平高于正常組織(P<0.01，圖1A)。免疫組化結(jié)果顯示，53例結(jié)直腸癌組織中YTHDF1蛋白的免疫評分(7.0±2.1)高于癌旁組織(5.0±1.5)(P<0.01，圖1B、C)。

圖1 A.TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)直腸癌與正常組織YTHDF1 mRNA的表達(dá)；B.53對結(jié)直腸癌及癌旁組織中YTHDF1蛋白免疫評分統(tǒng)計圖；C.結(jié)直腸癌及癌旁組織中YTHDF1蛋白表達(dá)，SP法；**P<0.01

2.2 驗證YTHDF1-shRNA的敲減效率應(yīng)用Western blot法檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中YTHDF1蛋白表達(dá)水平，選取YTHDF1蛋白水平較高的HCT116構(gòu)建敲減細(xì)胞株。Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，敲減組細(xì)胞中YTHDF1表達(dá)顯著降低，且在shRNA-3組細(xì)胞中表達(dá)量最低，因此選取shRNA-3組用于后續(xù)試驗(圖2)。

圖2 A.Western blot檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中YTHDF1的表達(dá)；B.Western blot檢測敲減效率

2.3 敲減YTHDF1對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響CCK-8和平板克隆實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，shRNA-3組細(xì)胞的生長速度減慢(P<0.05，圖3)。

圖3 CCK-8(A)和平板克隆實驗(B)檢測敲減YTHDF1對HCT116細(xì)胞增殖的影響：*P<0.05，**P<0.01

2.4 敲減YTHDF1對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響劃痕愈合(圖4)和Transwell實驗(圖5)結(jié)果顯示：與對照組相比，shRNA-3組細(xì)胞的遷移能力明顯減弱(P<0.05)。

圖4 劃痕愈合實驗檢測敲減YTHDF1對HCT116細(xì)胞遷移的影響：*P<0.05

圖5 Transwell實驗檢測敲減YTHDF1對HCT116細(xì)胞遷移的影響：*P<0.05

2.5 結(jié)直腸癌組織中YTHDF1表達(dá)與CD4+T、CD8+T及Treg細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性下載TCGA-COAD-READ的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，按照YTHDF1 mRNA中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，ssGSEA評估TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌樣本的免疫細(xì)胞浸潤情況，與YTHDF1低表達(dá)組相比，YTHDF1高表達(dá)組中CD4+T、CD8+T、Treg細(xì)胞的浸潤減少(P<0.01，圖6)。免疫組化結(jié)果顯示：YTHDF1表達(dá)與CD4+T、CD8+T細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，與Foxp3+Treg細(xì)胞浸潤水平呈正相關(guān)(P<0.01，圖7)。

圖6 ssGSEA評估YTHDF1 mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境23種免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系：*P<0.05,**P<0.01

圖7 A.結(jié)直腸癌組織中YTHDF1、CD4、CD8、Foxp3的表達(dá)，SP法；B.YTHDF1表達(dá)與CD4+、CD8+、Foxp3+免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性

2.6 YTHDF1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，YTHDF1表達(dá)與患者年齡(P=0.033)、臨床分期(P=0.013)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.016)顯著相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 YTHDF1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

YTHDF1是m6A結(jié)合蛋白，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[15]。有研究表明YTHDF1在結(jié)直腸癌中過度表達(dá)，沉默YTHDF1可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路活性，進(jìn)而影響體外結(jié)直腸癌細(xì)胞的致瘤性和體內(nèi)異種移植瘤的生長[16]。本實驗通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫及53對結(jié)直腸癌與正常組織中YTHDF1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YTHDF1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于正常組織，與文獻(xiàn)報道一致。在乳腺癌中，YTHDF1可以通過調(diào)控FOXM1促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移[17]；YTHDF1還通過調(diào)節(jié)CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復(fù)合物亞基7(CNOT7)的m6A水平來調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。上述結(jié)果表明YTHDF1可能與多種腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)敲減YTHDF1可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，這表明YTHDF1可能有促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。

YTHDF1與癌癥相關(guān)的主要功能富集在抗原提呈和CD8+T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)方面[8,19]，提示腫瘤組織中YTHDF1表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)TME中免疫細(xì)胞的浸潤而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在TME中，CD4+T細(xì)胞主要通過增強(qiáng)抗原提呈能力發(fā)揮抗腫瘤作用[20]，而CD8+T細(xì)胞主要通過分泌穿孔素、顆粒酶B等殺傷腫瘤細(xì)胞[21]。本實驗結(jié)合生信及免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：YTHDF1表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)。Treg細(xì)胞通過細(xì)胞間直接接觸或釋放細(xì)胞因子來抑制CD8+T細(xì)胞活性[22]。Foxp3+T細(xì)胞通常被直接認(rèn)定為Treg細(xì)胞。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，YTHDF1表達(dá)與Treg浸潤水平呈正相關(guān)；而生信分析結(jié)果中，YTHDF1表達(dá)與Treg浸潤呈負(fù)相關(guān)趨勢。這種差異可能是因為Treg細(xì)胞存在不同亞群，即eTreg和non-Treg，兩者難以通過免疫組化標(biāo)記區(qū)分[23]?？傊?，YTHDF1異常表達(dá)可能通過某種特定的機(jī)制改變結(jié)直腸癌中免疫細(xì)胞的浸潤水平，從而影響腫瘤進(jìn)展和免疫治療的療效。

本文對YTHDF1表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫473例結(jié)直腸癌的臨床病理特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF1表達(dá)與患者年齡、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。而分析本文收集的53例結(jié)直腸癌臨床病理數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于樣本量偏少，本課題組將收集更多結(jié)直腸癌臨床樣本進(jìn)一步分析。

綜上，YTHDF1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移，還與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，表明YTHDF1可能通過調(diào)控結(jié)直腸癌TME中免疫細(xì)胞浸潤豐度參與腫瘤惡性進(jìn)展。本研究僅揭示了YTHDF1表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞功能、免疫浸潤的關(guān)系，但其具體機(jī)制仍未闡明。因此，本課題組將進(jìn)一步研究YTHDF1調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤的具體機(jī)制，為結(jié)直腸癌的免疫治療提供實驗依據(jù)。