藍(lán)煒強(qiáng)，陳光文，楊依昂，周香圓，吳海波，章毓廳，孫紫洋，2,3，金 玉，2,4，樸俊杰，2,3

鐵死亡(ferroptosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的一種程序性死亡方式[1]。細(xì)胞鐵死亡過程伴隨著大量鐵離子的累積和脂質(zhì)過氧化[2]。近年來，越來越多的研究證實(shí)鐵死亡相關(guān)蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，被認(rèn)為可預(yù)測(cè)多種腫瘤的預(yù)后，如FTH1[3]、NCOA4[4]、SLC7A11[5]、HMOX1[6]等。GPX4屬于磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)，是鐵死亡的關(guān)鍵蛋白之一[7]。GPX4蛋白在細(xì)胞中具有清除脂質(zhì)過氧化物的作用，GPX4失活可導(dǎo)致氧化平衡被打破，脂質(zhì)過氧化物破壞膜結(jié)構(gòu)，從而激發(fā)鐵死亡[8]。有研究[9]顯示GPX4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在乳腺癌[10]、淋巴瘤[11]、肝癌[12]等腫瘤中GPX4蛋白表達(dá)高于正常組織。目前尚未見GPX4表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)GPX4在結(jié)腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，探討GPX4蛋白及GPX4和GNL3蛋白的聯(lián)合作用在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床材料人類結(jié)腸癌組織芯片購自上海芯超生物公司。該芯片有149個(gè)位點(diǎn)，包括82例原發(fā)結(jié)腸癌標(biāo)本和67例癌旁標(biāo)本。82例結(jié)腸癌中，男性40例，女性42例；患者年齡27～90歲，其中年齡<60歲25例，≥60歲57例；依據(jù)國際AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ+Ⅱ期51例，Ⅲ+Ⅳ期31例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者4例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者78例。82例結(jié)腸癌患者手術(shù)時(shí)間為2007年6月至2008年4月，并對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，每3個(gè)月進(jìn)行電話隨訪1次，隨訪截至2015年7月。

1.2 總RNA提取和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)8例新鮮結(jié)腸癌和癌旁正常組織由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤組織庫提供。組織樣品置于研缽磨中磨碎，利用TRIzol等試劑提取組織中的總RNA。采用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，利用SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測(cè)GPX4基因表達(dá)情況。GPX4引物序列如下GPX4-F：5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′；GPX4-R：5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s(合計(jì)40個(gè)循環(huán))，利用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用SP法。組織芯片60 ℃烤箱脫蠟，常溫烘干，二甲苯脫蠟，PBS洗3次；應(yīng)用檸檬酸鹽高溫修復(fù)抗原，BSA封閉，PBS洗3次；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加入一抗GPX4(稀釋比1∶100，Proteintech，美國)4 ℃孵育過夜；加入二抗(北京中杉金橋公司)37 ℃孵育20 min，PBS洗3次；滴加DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固。

1.4 結(jié)果判定邀請(qǐng)3位病理學(xué)專家分別評(píng)估結(jié)腸癌組織中GPX4蛋白表達(dá)水平：(1)以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色顆粒視為GPX4蛋白陽性；(2)根據(jù)陽性染色強(qiáng)度按未著色、淡褐色、褐色、棕褐色分成4個(gè)等級(jí)，分別判為0、1、2、3分；(3)將陽性面積占比按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分成5個(gè)等級(jí)，分別判為0、1、2、3、4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘記為總評(píng)分：0～3分為陰性(-)，4～6分為弱陽性(+)，7～9分為陽性()，10～12分為強(qiáng)陽性()。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620由延邊大學(xué)腫瘤研究中心組織庫提供。SW620細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2天換液，34天傳代。

1.6 Western blot法應(yīng)用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW620細(xì)胞敲低GNL3后GPX4和GNL3蛋白的表達(dá)。RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度。變性，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜。5%牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜。TBST洗膜，二抗孵育1 h。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像儀曝光。

1.7 慢性毒轉(zhuǎn)染將SW620細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種到24孔板，過夜。第2天，用2 mL含6 mg/L polybrene的新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)基，并加入適量慢病毒懸液。培養(yǎng)24 h后，用新鮮培養(yǎng)基替換，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行沉默效率的驗(yàn)證。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)計(jì)算分類變量的組間差異，運(yùn)用Kaplan-Meier法和Cox回歸模型進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中GPX4 mRNA的表達(dá)GEO數(shù)據(jù)庫(GSE74604)分析結(jié)果顯示：結(jié)腸癌組織中GPX4 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織(圖1A)。qRT-PCR檢測(cè)8例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中GPX4 mRNA表達(dá)普遍高于癌旁組織(圖1B)。

圖1 結(jié)腸癌及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達(dá)：A.GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)腸癌組織中GPX4 mRNA的表達(dá)；B.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸癌及癌旁組織中GPX4 mRNA的表達(dá)

2.2 結(jié)腸癌組織中GPX4蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2)。GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為91.5%(75/82)和43.9%(36/82)；在癌旁組織中的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為32.8%(22/67)和3.0%(2/67)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2，表1)。以上結(jié)果說明，GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。

圖2 結(jié)腸癌及癌旁組織中GPX4蛋白的表達(dá)，SP法：A.GPX4蛋白在癌旁組織中呈陰性；B.GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中呈弱陽性；C.GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中呈陽性；D.GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中呈強(qiáng)陽性

表1 不同結(jié)腸組織中GPX4蛋白的表達(dá)

2.3 結(jié)腸癌中GPX4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)腸癌組織中GPX4蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、病理分級(jí)、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=0.610，P=0.627)均無相關(guān)性(P>0.05)。GPX4蛋白在腫瘤直徑≤6 cm和>6 cm結(jié)腸癌組織中的強(qiáng)陽性率分別為55.3%和31.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 結(jié)腸癌中GPX4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 GPX4蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示：GPX4蛋白強(qiáng)陽性結(jié)腸癌患者的總生存率顯著低于GPX4蛋白非強(qiáng)陽性患者(P=0.03，圖3)。為進(jìn)一步探尋GPX4蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響，分別將結(jié)腸癌浸潤深度、病理分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況分成亞組進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示在浸潤深度T1～3、病理分級(jí)Ⅱ～Ⅳ、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移亞組中GPX4蛋白強(qiáng)陽性者預(yù)后較非強(qiáng)陽性者差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 結(jié)腸癌中GPX4蛋白表達(dá)與患者生存率的關(guān)系：A.GPX4表達(dá)與結(jié)腸癌患者總生存率之間的關(guān)系；B.浸潤深度pT1～3結(jié)腸癌中GPX4表達(dá)與患者生存率的關(guān)系；C.病理分級(jí)Ⅱ～Ⅳ結(jié)腸癌中GPX4表達(dá)與患者生存率的關(guān)系；D.無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌中GPX4表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

單因素Cox回歸分析顯示：GPX4蛋白強(qiáng)陽性(P=0.035)、浸潤深度T4(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.002)、AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期(P<0.001)是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(表3)。將上述有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示GPX4蛋白強(qiáng)陽性(P=0.019)和浸潤深度T4(P=0.035)是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(表3)。

表3 單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)腸癌患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素

2.5 聯(lián)合評(píng)估GPX4與GNL3蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)作用χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中GPX4蛋白表達(dá)與GNL3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(χ2=4.367，P=0.037，表4)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SW620細(xì)胞中敲低GNL3表達(dá)可誘導(dǎo)GPX4蛋白表達(dá)減少(圖4)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：GPX4和GNL3均強(qiáng)陽性患者的生存率低于GPX4強(qiáng)陽性、GNL3非強(qiáng)陽性患者(P=0.007，圖5)。

圖4 Western blot法檢測(cè)敲低GNL3后GPX4蛋白表達(dá)的改變

圖5 GPX4和GNL3表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)系

表4 結(jié)腸癌組織中GPX4與GNL3蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌是全球常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率與日俱增[13]。結(jié)直腸癌常用的治療方式為手術(shù)治療，術(shù)后輔以放、化療，然而疾病治療的前提是早期準(zhǔn)確診斷[14]。結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物在結(jié)腸癌的診斷中具有重要意義。腫瘤標(biāo)志物是在腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞膜表面，或機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)產(chǎn)生，分泌或釋放到人體體液或組織中的物質(zhì)[15]。腫瘤標(biāo)志物在腫瘤患者的早期診斷、制定治療計(jì)劃、預(yù)后評(píng)估、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面具有重要的參考價(jià)值[16]。因此，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物是提高結(jié)腸癌患者生存率的重要途徑。

GPX4是GPX的亞型之一，相比其他亞型，GPX4的作用是將脂質(zhì)氫過氧化物還原為無毒脂質(zhì)醇，從而限制了脂質(zhì)過氧化物在細(xì)胞膜內(nèi)的傳播，具有特異性催化細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物降解的能力[17-18]。有研究表明，GPX4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，如Peng等[19]發(fā)現(xiàn)GPX4通過調(diào)控活性氧(reactive oxygen species, ROS)影響腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。此外，GPX4還可以通過介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的鐵死亡過程來降低其對(duì)放療的耐藥[20]。除了通過調(diào)節(jié)鐵死亡，GPX4還可以通過維持腫瘤干細(xì)胞特性，進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌及胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力[18-19]。說明GPX4在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)82例結(jié)腸癌組織和67例癌旁組織中GPX4蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPX4蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且其表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤直徑密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)與最近其它研究結(jié)果一致。例如，王首寒等[21]發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，胃癌組織中GPX4表達(dá)增加；Zhao等[22]同樣發(fā)現(xiàn)GPX4蛋白在膠質(zhì)瘤中異常高表達(dá)。Kinowaki等[11]報(bào)道GPX4過表達(dá)可抑制ROS介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡。眾所周知，腫瘤細(xì)胞因其代謝活躍，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物及氧化物，而GPX4高表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，使得癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，抵抗凋亡，進(jìn)而促進(jìn)疾病的發(fā)展。生存分析結(jié)果顯示，GPX4蛋白強(qiáng)陽性患者的生存率與GPX4蛋白非強(qiáng)陽性患者相比明顯降低，提示GPX4蛋白高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GPX4能夠與mTOR信號(hào)通路相互作用[23]，然而該通路是否在結(jié)腸癌中發(fā)揮調(diào)控作用有待進(jìn)一步探究。

GNL3是一種多功能蛋白，在細(xì)胞自我更新、細(xì)胞增殖、凋亡、維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性和端粒完整性等多種細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPX4蛋白表達(dá)水平受GNL3蛋白的調(diào)控，說明GPX4、GNL3蛋白在結(jié)腸癌中共同作用參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，結(jié)腸癌組織中GPX4表達(dá)異常增高可能與GNL3蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。然而，GNL3通過何種途徑調(diào)控GPX4蛋白表達(dá)，以及兩者在結(jié)腸癌中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

綜上，GPX4高表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，GPX4可作為結(jié)腸癌潛在的分子標(biāo)志物以及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。然而，GPX4在結(jié)腸癌中的分子機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步深入探究。