周軍，唐志堅(jiān)，吳雅奇，劉勝文，王煜

海藻酸鈉是一種來自海藻細(xì)胞壁的高分子聚合物。在二價(jià)陽離子的作用下形成水凝膠（alginate hydrogel，AH）。AH 在制藥、心肌和骨骼修復(fù)中廣泛使用[1-3]。AH 與中樞神經(jīng)組織有著良好的組織相容性，并被用于脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的研究。采用傳統(tǒng)方法交聯(lián)得到的AH 凝膠，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有一定隨機(jī)性，常呈蜂窩或海綿狀[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)采用重力滲透二價(jià)陽離子（如Zn2+）的方法可以得到具有線性微管道結(jié)構(gòu)的AH 三維支架，移植AH 后對SCI有一定的修復(fù)作用[5]。但是，AH三維支架的理化特性和生物學(xué)穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步探索。

由于SCI后脊髓組織發(fā)生壞死，形成囊腔，脊髓神經(jīng)環(huán)路被中斷，而內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞對損傷組織的修復(fù)作用有限，大部分參與形成膠質(zhì)瘢痕，進(jìn)一步阻止軸突的再生[6]。因此，外源性細(xì)胞移植成為治療SCI 的重要方法之一。AH 三維支架作為移植細(xì)胞的載體可以有效修復(fù)組織的連續(xù)性，引導(dǎo)軸突再生。但是再生軸突為脊髓固有神經(jīng)元纖維而非調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的皮質(zhì)脊髓束，難以達(dá)到滿意的功能恢復(fù)[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脊髓神經(jīng)干/祖細(xì)胞（neural stem progenitor cells，NSPCs）具有更接近脊髓組織特征，既可以分化成神經(jīng)元發(fā)出大量軸突，也可以促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束在傷灶內(nèi)的再生，重建神經(jīng)功能[8]。本研究進(jìn)一步明確Zn2+交聯(lián)的AH三維支架的理化特性，并在體外條件下探索AH 三維支架與脊髓NSPCs 的生物相容性，為下一步的體內(nèi)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，同系交配后取孕14 d 的胎鼠。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與材料 海藻酸鈉粉末、明膠、氯化鋅粉末及六亞甲基二異氰酸酯（hexamethylene diisocyanate，HDI）、多聚甲醛、BCA蛋白測定試劑盒均購于Sigma 公司；無菌去離子水及無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）購于Biosharp公司；不銹鋼模具、Neurobasal 無血清培養(yǎng)基、B-27、神經(jīng)營養(yǎng)因子（腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、MDL28170）[9]、胰蛋白酶、Triton-100X及Tris緩沖鹽溶液（Tris buffer saline，TBS）均購于gibco 公司；山羊血清、Tuj-1、Nestin 及Olig2 單克隆抗體、Alexa Fluor 488交聯(lián)的熒光二抗、MTT增殖檢測試劑盒購于abcam公司；濃鹽酸、高氯酸、叔丁醇、干丙酮、濃硝酸均購于天津化工三廠。

1.2 方法

1.2.1 AH 三維支架的制備 將2 g 海藻鈉酸粉末和0.2 g明膠溶于無菌去離子水，攪拌6 h（1000 r/min），配制成100 mL 海藻酸鈉明膠（增加支架的穩(wěn)定性）混合溶液，經(jīng)聚醚砜膜（孔徑0.2 μm）過濾后倒入圓柱形不銹鋼模具（直徑5.0 cm，高度4 cm）。室溫下靜置24 h去除氣泡。將氯化鋅粉末溶于無菌去離子水（濃度1 mol/L），經(jīng)聚醚砜膜過濾后注入噴霧瓶，噴霧瓶口高于海藻酸鈉明膠混合溶液的液面20 cm噴灑至模具裝滿氯化鋅溶液。室溫下靜置48 h 后取出交聯(lián)形成的AH 三維支架置于無菌去離子水中浸泡4 次（1 h/次）。切除支架頂部和底部無管道結(jié)構(gòu)部分后將其置于500 mL 干丙酮溶液中浸泡4 次（1 h/次）。將AH 轉(zhuǎn)移到0.1 mol/L的HDI-干丙酮溶液中固化4 h后置于干丙酮中浸泡洗滌4次（0.5 h/次）去除多余HDI。用吸水紙吸除AH 表面丙酮后置于70 ℃的500 mL 無菌去離子水中浸泡直至凝膠表面無氣泡產(chǎn)生（留取部分樣本用于殘留離子測定）。將AH 置于0.1 mol/L 的鹽酸中浸泡8 次（15 min/次）以去除多余的金屬離子，再用無菌去離子水浸泡AH至溶液pH呈中性。將所得到的AH保存在75%酒精中備用。AH使用前，用無菌PBS洗滌3次（1 h/次）。

1.2.2 AH 三維支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的測定 將AH 置于震蕩切片機(jī)上切割成5×5×5 mm大小的立方體并放在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入3 mL 無菌PBS 沒過AH 后在培養(yǎng)箱中孵育，每隔3天更換1次PBS，每次換液后，光鏡下觀察海藻酸鈉AH的孔隙結(jié)構(gòu)并用吸水紙吸出PBS后稱重，孵育時(shí)間18周。

1.2.3 AH 三維支架離子殘留測定 將尚未用鹽酸浸泡洗滌的樣本切割成5×5×5 mm 的立方體，冷凍干燥后稱重，并置于2 mL濃硝酸中，120 ℃下加熱至濃硝酸完全揮發(fā)，再次加入2 mL 濃高氯酸，加熱至完全揮發(fā)。重復(fù)加入濃縮高氯酸直至殘留物為無色，將其溶解于0.5 mol/L 硝酸溶液，光譜分析儀測定硝酸溶液中金屬離子含量。收集經(jīng)過0.1 mol/L鹽酸浸泡不同次數(shù)后的AH，用無菌去離子水洗滌至中性，重復(fù)上述步驟，測定不同鹽酸洗滌次數(shù)后，AH中殘留金屬離子含量。

1.2.4 AH三維支架內(nèi)明膠蛋白含量測定（BCA法）將AH 三維支架置于干燥器（60 ℃）內(nèi)烘干，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白或干燥的支架并置于BCA 工作液（37 ℃）中震蕩浸泡30 min，酶標(biāo)儀（562 nm）測定吸光度。

1.2.5 AH 超微結(jié)構(gòu)分析 將AH 放在震蕩切片機(jī)上切割形成2×2×2 mm 大小的立方體，分別置于30%、50%、70%、90%和100%的乙醇中梯度脫水（10 min/濃度）后放在叔丁醇中浸泡5 min，經(jīng)真空冷凍干燥48 h后涂覆10 nm金膜，掃描電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 脊髓來源的NSPCs的分離和培養(yǎng) 將孕期14 d的SD 大鼠斷頸處死，醫(yī)用酒精浸泡，剪開腹部取出子宮，在無菌PBS 溶液中分離出胚胎。在冰上用無菌PBS 清洗3 次后置于培養(yǎng)皿中，顯微鏡下分離胚胎脊髓，剝除脊膜，PBS清洗3次，將脊髓剪成1×1×1 mm的組織塊。用0.25%胰蛋白酶處理后過濾，離心得到NSPCs，重懸于含有2% B27 和神經(jīng)營養(yǎng)因子的Neurobasal 培養(yǎng)基中。

1.2.7 AH 與NSPCs 共培養(yǎng) 將得到的NSPCs 懸液滴加到AH 支架（2×2×2 mm，細(xì)胞數(shù)～106/支架）的管道中或AH 支架切片（0.5×4×4 mm，細(xì)胞數(shù)～106/切片）上。將含有NSPCs 的支架或切片置于含有2%B27-Neurobasal 培養(yǎng)基的96 孔板中培養(yǎng)，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察支架管道中細(xì)胞情況。

1.2.8 AH 對NSPCs 存活率影響的測定 NSPCs 在AH 切片上培養(yǎng)后，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗后每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h 后棄去上清，孔內(nèi)加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min后在酶標(biāo)儀上測定每孔吸光值。

1.2.9 免疫熒光染色 將單獨(dú)培養(yǎng)或與AH 共培養(yǎng)細(xì)胞用TBS 洗滌后于多聚甲醛中固定15 min，TBS 洗滌3 次，在含5%山羊血清/0.25%Triton X-100 的TBS 封閉1 h，TBS 洗滌3 次，含有1%山羊血清的一抗在4 ℃下孵育過夜，TBS 洗滌3 次后用熒光二抗在室溫下避光孵育2 h，TBS 洗滌后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行制圖、數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 AH三維支架的管道結(jié)構(gòu)及理化特性

Zn2+與海藻酸鈉水溶液交聯(lián)形成AH，大體結(jié)構(gòu)顏色呈半透明，彈性良好。光鏡下，AH 內(nèi)含有均一線性平行的微管道，管道分布均勻，管道直徑為（93.26±6.24）μm，管道密度為（9.72±2.37）/mm2，管道孔隙率為（66.22±8.97）%。在掃面電鏡下可見管道內(nèi)部的微小突起。交聯(lián)的AH支架經(jīng)過8次洗滌后其所含Zn2+劑量低于0.1 nmoL/mg（0.08 nmoL/mg），明膠含量為（0.11±0.03）mg/mgAH干重，且支架的管道結(jié)構(gòu)能夠保持長期穩(wěn)定，體外孵育18周后未發(fā)生明顯降解反應(yīng)，見圖1。

圖1 AH三維支架的制備和理化特征

2.2 脊髓NSPCs具有良好的增殖和分化能力

胚胎源性的脊髓NSPCs 在含有神經(jīng)營養(yǎng)因子的Neurobasal 培養(yǎng)基中培養(yǎng)后3 d內(nèi)聚集成球，干細(xì)胞標(biāo)記Nestin強(qiáng)陽性表達(dá)，1周后細(xì)胞球貼壁生長并分化成神經(jīng)元，延伸出大量的Tuj-1（+）的突起，部分細(xì)胞分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，見圖2。

圖2 脊髓NSPCs的分離和鑒定

2.3 AH對NSPCs增殖和分化的影響

脊髓NSPCs在含神經(jīng)營養(yǎng)因子的Neurobasal 培養(yǎng)基中貼覆于AH表面成球生長，1周后部分分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。其細(xì)胞存活率＞90%，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長無明顯變化。掃描電鏡下可見NSPCs粘附于管道表面，并分化成神經(jīng)元細(xì)胞，見圖3。

圖3 AH三維支架與NSPCs的生物相容性

3 討論

本研究探索了Zn2+交聯(lián)的AH 生物支架的理化特性和超微結(jié)構(gòu)特征，證實(shí)了其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其與脊髓NSPCs良好的生物相容性。

AH移植治療SCI已經(jīng)廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究，其優(yōu)勢在于：填充SCI形成的囊腔，恢復(fù)脊髓結(jié)構(gòu)的連續(xù)性；作為細(xì)胞的載體，減少移植細(xì)胞的用量；為移植細(xì)胞提供免疫屏障，防止或減少排斥反應(yīng)；持續(xù)釋放生物活性分子，并使其在局部發(fā)揮作用，提高治療效率[10]。此外，AH內(nèi)部的微管道結(jié)構(gòu)還可以引導(dǎo)軸突呈接近生理狀態(tài)的線性生長，使更多的再生軸突跨過傷灶進(jìn)入正常脊髓組織建立突觸聯(lián)系[11]。

雖然藻酸鹽形成的AH在不同的疾病模型中已有廣泛的研究[3]，但大多數(shù)采用的AH無固定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)受制備環(huán)境和技術(shù)的影響變異較大。常用的方法包括二價(jià)陽離子（如Ca2+）直接混合或三維打印[10]，這些方法形成的AH 含有大量游離的二價(jià)陽離子。與這些方法相比，AH三維支架的制備條件更為苛刻。且制備過程中通過8次以上的鹽酸洗滌后，Zn2+的檢出濃度極低，從而避免過多的離子影響移植細(xì)胞的存活或?qū)κ荏w組織造成附加損傷[12]。此外，移植物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能夠保持較長時(shí)間的穩(wěn)定性是神經(jīng)軸突持續(xù)再生的重要前提[10]。因此，通過體外模擬降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AH三維支架的管道結(jié)構(gòu)能夠保持穩(wěn)定而不發(fā)生降解。

在慢性SCI的動(dòng)物模型中，AH三維支架與脊髓組織有著良好的組織相容性，并促進(jìn)少量的軸突再生，受體大鼠表現(xiàn)出了一定的功能恢復(fù)[13]。在急性SCI 的動(dòng)物模型中，將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞[11]、施萬細(xì)胞[5]和星形膠質(zhì)細(xì)胞種植于AH 中移植到脊髓組織后，可見大量的軸突生長進(jìn)入傷灶，通過增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)或正常脊髓內(nèi)注射移植細(xì)胞，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)再生軸突進(jìn)入脊髓組織。由于再生的軸突來自脊髓固有神經(jīng)元，對肢體感覺和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)作用有限。因此，深入了解AH 的特性并優(yōu)化移植策略才能進(jìn)一步改善AH的治療作用。

脊髓NSPCs 具有向脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能，能很好的修復(fù)損傷的脊髓組織。移植脊髓NSPCs至SCI病灶后分化成的神經(jīng)元可以形成類似脊髓灰質(zhì)的板層結(jié)構(gòu)，其發(fā)出大量的軸突與正常脊髓組織內(nèi)的神經(jīng)元胞體形成突觸連接[14]。但脊髓NSPCs的細(xì)胞來源受到倫理學(xué)限制，難以滿足大量SCI 患者的需求。NSPCs 聯(lián)合AH 移植則可以減少細(xì)胞的用量，且AH的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以引導(dǎo)再生軸突的定向生長。在本研究的體外試驗(yàn)中，NSPCs 可以附著于AH 表面成球生長，增殖和分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。AH與NSPCs良好的生物相容性為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究使用Zn2+與海藻酸溶液交聯(lián)制備的AH 三維支架，具有良好拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和對脊髓NSPCs 的生物相容性，為探索AH 三維支架聯(lián)合NSPCs在體移植對脊髓損傷的修復(fù)作用提供了依據(jù)。