唐玥，陳曼，初云惠，龐曉偉，秦川，田代實(shí)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中的主要細(xì)胞成分，在多種神經(jīng)病理?yè)p傷中被廣泛激活[1,2]。小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活會(huì)釋放各種有毒神經(jīng)介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[3]。適當(dāng)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥表型以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活，是減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要手段。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的有效刺激物[4]，可以很好地模擬體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)。

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是一類(lèi)含有共軛雙鍵的亞油酸同分異構(gòu)體的混合物，具有多種生物學(xué)功能，如抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，CLA可以下調(diào)促炎因子CD68、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，并上調(diào)CD206、IL-4、IL-10的表達(dá)以增加抗炎型巨噬細(xì)胞含量[7,9]。過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)中起著非常重要的作用[10]，拮抗PPARγ可促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞從促炎型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔蚚11]。CLA 是PPARγ天然配體之一，CLA 部分通過(guò)PPARγ通路發(fā)揮其減輕動(dòng)脈粥樣硬化的作用[8,12,13]。據(jù)此我們猜測(cè)CLA 也可通過(guò)PPARγ通路影響小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥表型。本研究將在體外構(gòu)建LPS刺激原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥模型，分析CLA調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥表型的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生0～3 d 的C57 小鼠乳鼠100只，雌雄不限，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑和材料 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM/F12 培養(yǎng)基、胰酶（含EDTA，0.25%）、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；c9-CLA、t11-CLA購(gòu)于Cayman公司；LPS購(gòu)于Sigma 公司；GW9662 購(gòu)于MedChemExpress 公司；一抗CD206 購(gòu)于R&D 公司，CD16/32 購(gòu)于BD 公司，Iba1 購(gòu)于CST 公司；Alexa Flour 594 標(biāo)記驢抗兔IgG（H+L），Alexa Flour 488 標(biāo)記驢抗山羊IgG（H+L）、驢抗大鼠IgG（H+L），4%多聚甲醛，免疫熒光通透液，免疫熒光封閉液，抗熒光淬滅封片劑購(gòu)于碧云天生物；TRIzol 購(gòu)于Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于翌圣生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 將C57乳鼠用75%酒精消毒后于生物安全柜中取出腦組織，剝離腦膜和血管，用0.25%的胰酶消化液在37℃溫箱中消化15 min，過(guò)濾離心后用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸接種至T75培養(yǎng)瓶中；第3天更換成DMEM高糖完全培養(yǎng)基；隨后培養(yǎng)至第12天左右分離上層小膠質(zhì)細(xì)胞；按6×104/cm2的密度接種至培養(yǎng)板中使細(xì)胞沉淀貼壁用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理 細(xì)胞貼壁后分別用LPS（100 ng/mL）、LPS+CLA（10 μM）、LPS+CLA+GW9662（10 nM）干預(yù)24 h，收集細(xì)胞RNA和爬片。

1.2.3 免疫熒光染色 細(xì)胞爬片用PBS 洗滌5 min，4%多聚甲醛室溫固定15 min 后；經(jīng)免疫熒光通透液及封閉液室溫先后孵育15 min，PBS 洗滌后加入一抗CD206（1∶200）、CD16/32（1∶50）、Iba1（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，PBS 洗滌3 遍，5 min/次；加入相對(duì)應(yīng)的二抗（1∶200）室溫孵育1 h；PBS 洗滌稍微晾干后加入含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察，圖片用ImageJ軟件分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 12 孔板中加入TRIzol 500 μL 裂解細(xì)胞。根據(jù)TRIzol 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取操作，最后將RNA溶解于20 μL DEPC水中，吸取2 μL RNA 樣品于ND 2000 下測(cè)核酸濃度以及A260/A280 比值（1.8～2.2）用于下一步實(shí)驗(yàn)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA。TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，iNOS，TGF-β引物（擎科生物）序列見(jiàn)表1，以β-Actin為內(nèi)參，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)說(shuō)明書(shū)配20 μL 體系進(jìn)行反應(yīng)。運(yùn)用CFXmanager 的2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS構(gòu)建體外小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型

為構(gòu)建體外小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，我們給予LPS刺激原代小膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)促炎分子IL-6（P＜0.0001）、iNOS（P＜0.0001）、IL-1β（P＜0.0001）和TNF-α（P＜0.0001）轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組明顯升高，見(jiàn)圖1A；而抗炎分子TGF-β（P＜0.0001）轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)。免疫熒光檢測(cè)也觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)促炎標(biāo)志物CD16/32（P＜0.0001）的表達(dá)水平顯著升高，而抗炎標(biāo)志物CD206（P＜0.01）明顯降低，見(jiàn)圖1 B。

2.2 CLA可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥極化

給予CLA（10 μM）處理24 h 后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：與單純LPS刺激組相比，CLA可下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎基因，如IL-6（P＜0.0001）、iNOS（P＜0.0001）、IL-1β（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.001），同時(shí)促進(jìn)抗炎基因IL-4（P＜0.001）、IL-10（P＜0.0001）、TGF-β（P＜0.0001）的上調(diào)，見(jiàn)圖1A。細(xì)胞染色也直觀反映了給與CLA 處理之后小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎標(biāo)志物CD206表達(dá)增多（P＜0.0001），而促炎標(biāo)志物CD16/32 表達(dá)減少（P＜0.001），見(jiàn)圖1 B；提示CLA 可以促進(jìn)促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型轉(zhuǎn)化。

2.3 CLA通過(guò)PPARγ通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥極化

為了進(jìn)一步探究CLA 促進(jìn)LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎表型向抗炎表型轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制，我們采用PPARγ的抑制劑GW9662干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)相較于LPS+CLA 組，給予GW9662 干預(yù)后，促炎基因IL-6（P＜0.0001）、iNOS（P＜0.001）、IL-1β（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.001）表達(dá)上調(diào)，抗炎基因IL-10（P＜0.0001）、IL-4（P＜0.001）、TGF-β（P＜0.0001）表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖2。免疫熒光染色顯示小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CD206表達(dá)水平在PPARγ通路被抑制后明顯下降（P＜0.0001），而CD16/32 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 給予GW9662抑制劑處理后，IL-6、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-4、TGF-β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

圖3 給予GW9662抑制劑處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CD206和CD16/32表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛活化，對(duì)腦實(shí)質(zhì)損傷產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、異常蛋白等內(nèi)源性刺激敏感并迅速做出反應(yīng)，可表現(xiàn)出經(jīng)典激活的促炎表型，釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等[14]促炎因子，同時(shí)上調(diào)氧化還原分子iNOS[15]和炎癥小體復(fù)合物NLRP3[16]，從而加重神經(jīng)損傷。另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞亦可表現(xiàn)出抗炎表型，如IL-4、IL-10、TGF-β以及CD206 等抗炎因子表達(dá)增多，促進(jìn)炎癥消退、建立新的穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮修復(fù)功能[17,18]。多個(gè)研究表明促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型極化，有助于減輕病理?yè)p傷[19-21]。例如針對(duì)多發(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病這類(lèi)炎性脫髓鞘疾病，給予抗炎治療是非常重要的[22]?；诖耍狙芯恐荚谔骄咳绾握{(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥極化，從而改善疾病狀態(tài)下的炎癥微環(huán)境，減緩疾病進(jìn)展。LPS 構(gòu)建的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型可以很好地模擬體內(nèi)的炎癥微環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中在體外給與LPS 刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞后，其促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和CD16/32 表達(dá)顯著升高，而抗炎因子CD206、IL-4、IL-10、TGF-β表達(dá)被抑制，說(shuō)明離體條件下LPS激活了小膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為促炎表型。我們?cè)诖四Ｐ蜕辖o予CLA處理，觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎表型轉(zhuǎn)化為抗炎表型。

CLA 通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的促炎表型發(fā)揮抗炎作用。研究表明CLA 喂食動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠可以抑制促炎型單核巨噬細(xì)胞極化而促進(jìn)其向抗炎型分化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-10同時(shí)抑制iNOS、TNF-α的表達(dá)[23]。但CLA調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥極化的證據(jù)尚不足，目前有研究報(bào)道在阿爾茲海默病疾病模型中，給予CLA喂食后小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD206增多[24]。CLA能否在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥微環(huán)境中調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型轉(zhuǎn)化，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活從而減輕炎癥反應(yīng)，有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)相較于單純LPS 刺激，給予CLA 處理之后，小膠質(zhì)細(xì)胞促炎基因顯著下調(diào)，而抗炎因子表達(dá)增多，提示小膠質(zhì)細(xì)胞由促炎表型向抗炎表型轉(zhuǎn)化，說(shuō)明體外條件下CLA可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥極化。

PPARγ通路可以被多種脂肪酸代謝產(chǎn)物激活[25]，CLA可與PPARγ結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，CLA 激活PPARγ通路，抑制促炎因子表達(dá)，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向抗炎型極化[12]。PPARγ也被證明是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)化的主要調(diào)節(jié)因子[26]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CLA可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子表達(dá)，抑制PPARγ通路后，CLA促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型轉(zhuǎn)化的作用被弱化了，這提示CLA可能通過(guò)PPARγ途徑調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥極化。其具體機(jī)制有待更深入的探討，進(jìn)一步研究可以采用siRNA 敲除技術(shù)證實(shí)CLA 通過(guò)PPARγ通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞。

綜上所述，本研究在離體環(huán)境下，通過(guò)檢測(cè)分析促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、CD16/32和抗炎因子CD206、IL-4、IL-10、TGF-β的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CLA促進(jìn)LPS 刺激的促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型轉(zhuǎn)化；使用PPARγ通路抑制劑處理后，CLA的這種調(diào)控作用減弱，推測(cè)CLA 可能部分通過(guò)PPARγ途徑發(fā)揮其抗炎作用，但該研究存在局限性，需進(jìn)一步完善體內(nèi)動(dòng)物模型的驗(yàn)證?？梢詮腃LA影響小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及其他功能方面進(jìn)一步探究CLA調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制。