夏強(qiáng)，劉海燦，趙秀芹，萬(wàn)康林，趙麗麗

1.迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310012；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

WHO結(jié)核病治療指南顯示[1]，耐多藥結(jié)核（mutidrug resistant tuberculosis, MDR-TB）治療需要18～20個(gè)月的藥物療程，一旦出現(xiàn)患者依從性較差、發(fā)生嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)等情況，疾病不能被徹底根治而再次復(fù)發(fā)或演變成廣泛耐藥性結(jié)核（extensive drug resistant tuberculosis, XDRTB），給社會(huì)和患者帶來(lái)沉重的生理和心理負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，貝達(dá)喹啉、氯法齊明等口服新藥在國(guó)外已經(jīng)進(jìn)入MDR-TB臨床治療指南用于耐藥結(jié)核病的治療，并取得良好的效果[2]，但治療費(fèi)用普遍很高，在我國(guó)二線抗結(jié)核藥物氨基糖苷類卡那霉素（kanamycin,KAN）及多肽類藥物卷曲霉素（capreomycin, CAP）等注射劑由于價(jià)格便宜，臨床醫(yī)生擁有良好的使用經(jīng)驗(yàn)，仍是治療MDR-TB的重要藥物[3]。研究顯示[4]，氨基糖苷類藥物鏈霉素（streptomycin, SM）、KAN和多肽類藥物CAP的抗菌機(jī)制相似，導(dǎo)致了這些藥物存在交叉耐藥性，但是交叉耐藥的程度在不同地區(qū)的差異很大，是否與相關(guān)耐藥基因協(xié)同發(fā)揮作用，需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。本研究使用125株MDRTB臨床分離株對(duì)SM、KAN、CAP相關(guān)耐藥基因進(jìn)行研究，探索三個(gè)藥物耐藥及交叉耐藥之間的關(guān)系，有助于臨床更合理地應(yīng)用藥物，為耐多藥結(jié)核病的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源 本研究共使用125株MDR-TB菌株，均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Control and Prevention, CDC）傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室傳代培養(yǎng)、保藏，菌株來(lái)源詳細(xì)信息見(jiàn)表1。結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC27294）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，由CDC傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室保藏。

表1 125株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的地區(qū)來(lái)源

1.2 藥物敏感性檢測(cè) 本研究菌株的藥物敏感性檢測(cè)，使用比例法在改良羅氏培養(yǎng)基上按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行[5]，以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為質(zhì)控菌株，藥物購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。耐藥臨界濃度參照文獻(xiàn)[6]設(shè)置，SM為4 μg/mL，CAP為40 μg/mL，KAN為30 μg/mL。

1.3 分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株DNA的制備 結(jié)核分枝桿菌的DNA提取采用CTAB法[7]，用溶菌酶、10% SDS/蛋白酶K混合液及CTAB破除細(xì)胞壁，用氯仿萃取，冰乙醇洗滌DNA沉淀，最后用TE溶解DNA沉淀，-20 ℃保存。

1.4 基因擴(kuò)增與測(cè)序 使用NCBI網(wǎng)站公布的結(jié)核分枝桿菌株的H37Rv全基因組序列（NC_000962）作為模板，對(duì)rrs、tlyA、eis啟動(dòng)子、rpsL設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序引物，見(jiàn)表2。采用20 μL擴(kuò)增體系，包括1×easytaq PCR Buffer，1.25 U easytaq DNA聚合酶，0.125 mmol/L dNTP，F(xiàn)、R各0.15 μmol/L，模板DNA 40～100 ng。反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性5 min，再用94 ℃變性30 s、58 ℃復(fù)性30 s和72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科興業(yè)公司純化后進(jìn)行核酸序列測(cè)定，核酸序列比對(duì)使用Clustal W和Bio Edit等軟件完成。

表2 基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序的引物

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間差異用χ2檢驗(yàn)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 MDR-TB臨床分離株對(duì)3種藥物交叉耐藥性（株）

2.1 藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果 125株MDR-TB菌株中，SM耐藥株87例（占69.60%），CAP耐藥株14例（占11.20%），KAN耐藥株21例（占16.80%），SM耐藥率顯著高于CAP、KAN（χ2=88.53、65.54，均P＜0.01），而CAP與KAN間耐藥率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.63，P=0.20）。有68例（占54.40%）菌株對(duì)SM單耐受，有2例（占2.00%）菌株對(duì)CAP單耐受，有4例（占3.20%）菌株對(duì)KAN單耐受，有9例（占7.20%）菌株對(duì)SM+KAN耐受，有4例（占3.2%）菌株對(duì)SM+CAP耐受，有2例（占2.00%）菌株對(duì)KAN+CAP耐受，有6例（占4.80%）菌株對(duì)本研究中的3種抗結(jié)核藥物全部耐受，有30例（占24.00%）菌株對(duì)3種藥全部敏感。KAN在SM耐藥株中的耐藥率為17.20%（15/87），KAN在CAP耐藥株中的耐藥率為57.14%（8/14）；CAP在SM耐藥株中的耐藥率為11.49%（10/87），CAP在KAN耐藥株中的耐藥率為38.10%（8/21）；SM在KAN耐藥株中的耐藥率為71.43%（15/21），SM在CAP耐藥株中的耐藥率為71.43%（10/14）。

2.3 耐藥基因突變結(jié)果 通過(guò)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，68株單耐SM菌株中，有19例（占27.94%）菌株出現(xiàn)rpsL基因突變，128A-G（Lys43Arg）型突變?yōu)樽钪饕耐蛔?，共?4株；有6例（占8.82%）菌株出現(xiàn)rrs基因突變，類型分別為1401A-G、517C-T、48T-C、1141CT、635G-A、1449A-G。4株單耐KAN菌株中，有3例（占75.00%）菌株出現(xiàn)eis啟動(dòng)子突變，突變類型為2株G（-10）A突變和1株G（-14）A突變；有1例（占25.00%）菌株出現(xiàn)rrs基因1401A-G突變。2株CAP單耐菌株中，未發(fā)現(xiàn)基因突變。9株SM+KAN耐藥菌株中，有6例（占66.66%）菌株出現(xiàn)rpsL突變，其中4株為128A-G突變，2株為263A-G突變；有2例（占22.22%）菌株出現(xiàn)rrs突變，分別為1株514A-C突變以及1株517C-T突變；有1例（占11.11%）菌株出現(xiàn)eis啟動(dòng)子突變，突變類型為（-10）A。4株SM+CAP耐藥菌株中，有3例（75.00%）菌株出現(xiàn)rpsL突變，分別為2株128A-G突變、1株263A-G；rrs和eis啟動(dòng)子未出現(xiàn)突變。2株KAN+CAP耐藥株中，有1例（占50.00%）菌株出現(xiàn)rrs突變，突變類型為1401AG；rpsL和eis啟動(dòng)子未出現(xiàn)突變。6株SM+KAN+CAP耐藥菌株中，有3例（占50.00%）菌株出現(xiàn)rrs突變，其中2株為1401A-G基因突變，1株為rrs1401AG+rpsL128A-G突變；eis啟動(dòng)子未出現(xiàn)突變。30株SM+KAN+CAP敏感菌株中，1例（占3.33%）菌株出現(xiàn)rrs突變，突變類型為1057C-A；rpsL和eis啟動(dòng)子未出現(xiàn)突變。125株MDR-TB菌株中tlyA均發(fā)現(xiàn)33A-G突變，突變類型為同義突變，其中兩株為33A-G+463CT、33A-G+54A-G類型雙位點(diǎn)突變。見(jiàn)表3。

表3 SM、KAN及CAP相關(guān)耐藥基因突變結(jié)果分析

2.4 3種注射類藥物耐藥與耐藥基因突變間的關(guān)系 以表型耐藥為金標(biāo)準(zhǔn)，rpsL檢測(cè)SM+KAN聯(lián)合耐藥的靈敏度為46.67%，特異度為90.63%，rrs檢測(cè)SM+KAN聯(lián)合耐藥的靈敏度為33.33%，特異度為96.88%；而rpsL檢測(cè)KAN+CAP聯(lián)合耐藥的靈敏性僅有12.5%，特異度為80.61%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為5%；rrs檢測(cè)KAN+CAP聯(lián)合耐藥的靈敏度為50%，特異度為92.86%。rrs檢測(cè)SM+KAN+CAP聯(lián)合耐藥的靈敏度50%，特異度高達(dá)96.67%。SM+KAN耐藥菌株和SM+KAN敏感菌株的rrs突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.369，P=0.002）；SM+CAP耐藥菌株和SM+CAP敏感菌株的rrs突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.462，P=0.010）；KAN+CAP耐藥菌株和KAN+CAP敏感菌株的rrs突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.61，P＜0.001）；SM+KAN+CAP耐藥菌株和SM+KAN+CAP敏感菌株的rrs突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.03，P＜0.001）。見(jiàn)表4。

表4 3種藥物耐藥與基因突變的關(guān)系

3 討論

SM是治療結(jié)核最重要的一線藥物，而同為氨基糖苷類藥物的KAN和CAP是臨床治療二線注射類藥物，在MDR-TB標(biāo)準(zhǔn)短程化療方案中作為主要的核心藥物[3]。有研究顯示[8]，氨基糖苷類藥物之間以及與多肽類藥物之間耐藥機(jī)制互有交叉，導(dǎo)致交叉耐藥，分析兩類藥物的耐藥、交叉耐藥，及與分子耐藥機(jī)制關(guān)系，有助于臨床為結(jié)核病患者特別是MDRTB患者制定合理有效的化療方案提供理論依據(jù)。

本研究中125株MDR-TB菌株中，三種藥物耐藥率依次為60.00%（SM），16.80%（KAN），11.20%（CAP），耐藥率排位順序與2010年我國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致[9]。KAN在SM耐藥株中的耐藥率為17.20%，CAP在SM耐藥株中耐藥率為11.49%，SM在KAN耐藥株中耐藥率為71.43%，SM在CAP耐藥株中耐藥率為71.43%，據(jù)此可推斷，SM與KAN、CAP二藥之間存在著單向交叉耐藥，這與我國(guó)學(xué)者常珊等[10]研究成果一致。本研究結(jié)果分析，CAP對(duì)MDR-TB菌株的耐藥率與KAN的耐藥率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KAN在CAP耐藥株中的耐藥率為57.1%，CAP在KAN耐藥株中的耐藥率為38.09%，說(shuō)明KAN和CAP之間存在低水平交叉耐藥，提示二者間一種藥物發(fā)生耐藥，應(yīng)慎重選擇另外一種藥物。

目前研究認(rèn)為，三種藥物交叉耐藥產(chǎn)生的原因是由于存在共同的基因突變位置。rpsL基因是結(jié)核分枝桿菌對(duì)SM耐藥的分子機(jī)制[11]。本研究顯示，87株SM耐藥菌株中，共有33.33%（29/87）的菌株出現(xiàn)rpsL基因突變，其中Lys43Arg突變?yōu)?1株，Lys88Arg型突變?yōu)?株，另外發(fā)現(xiàn)1株Arg381Cys突變，未見(jiàn)報(bào)道；在38株SM敏感株中，包括4株KAN單耐，2株CAP單耐，2株KAN+CAP耐藥，30株SM+KAN+CAP敏感，未發(fā)現(xiàn)rpsL基因的突變。利用rpsL基因檢測(cè)檢測(cè)SM、KAN、CAP單耐藥的靈敏度分別為33.33%、33.33%、28.57%，特異度分別為100%、78.85%、77.48%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為100%、24.14%、13.79%，而rpsL基因KAN+CAP聯(lián)合耐藥的靈敏度僅為12.5%，特異度為80.61%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為5%，說(shuō)明在本研究中rpsL基因突變主要對(duì)SM耐藥起到貢獻(xiàn)，檢測(cè)與KAN及CAP耐藥能力較弱。

rrs基因編碼16S rRNA，該基因530環(huán)狀區(qū)域與rpsL第43位的賴氨酸在空間上非常接近，因此該區(qū)域基因位點(diǎn)突變與SM抗性有關(guān)，同時(shí)也是導(dǎo)致SM和KAN交叉耐藥關(guān)鍵區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)，87株SM耐藥株中，共有12.64%的菌株出現(xiàn)rrs基因突變，單耐SM菌株中rrs突變呈多態(tài)性，530環(huán)狀區(qū)域基因僅有1株516A-G突變，而在SM+KAN聯(lián)合耐藥的菌種，發(fā)現(xiàn)530環(huán)狀區(qū)域標(biāo)志性突變位點(diǎn)514A-C和517C-T突變各1株，在CAP耐藥株中并未出現(xiàn)。有研究證實(shí)[12-13]，rrs基因A1401G的突變位點(diǎn)與KAN、CAP耐藥相關(guān)，而且也是它們交叉耐藥的位點(diǎn)，A1401G位點(diǎn)檢測(cè)KAN單耐藥的敏感度和特異度分別為100%和98.1%；檢測(cè)CAP單耐藥的敏感度和特異度分別為93.3%、100%。本研究中，共發(fā)現(xiàn)6株rrs基因發(fā)生A1401G的突變，單耐SM和單耐KAN各1株，KAN+CAP聯(lián)合耐藥1株，SM+KAN+CPA聯(lián)合耐藥3株，而在單耐CAP菌株中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變。rrs基因A1401G連同514A-C和517C-T突變共同檢測(cè)SM+KAN+CAP交叉耐藥，靈敏度可以達(dá)到50%，提示該基因突變與三種藥物交叉耐藥具有關(guān)聯(lián)，但存在部分表型耐藥不能用現(xiàn)有突變位點(diǎn)解釋的現(xiàn)象。

結(jié)核分枝桿菌中tlyA（Rv1694）的轉(zhuǎn)座子突變導(dǎo)致CAP耐藥[14]。tlyA基因編碼一個(gè)2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，在16S rRNA的44號(hào)螺旋和23S rRNA的69號(hào)螺旋中產(chǎn)生甲基化。當(dāng)核糖體亞基形成復(fù)合物時(shí)，形成CAP的結(jié)合位點(diǎn)，抑制核糖體的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致耐藥。對(duì)于該基因突變報(bào)道不一，有研究顯示tlyA基因的突變率過(guò)低，并不是敏感的CAP耐藥檢測(cè)指標(biāo)[15]，而我國(guó)學(xué)者報(bào)道[16]，50株CAP臨床耐藥菌株中，有7株菌株發(fā)生了該基因突變，30株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)突變。本研究125株MDR-TB菌株中，均發(fā)現(xiàn)tlyA基因33A-G同義突變，另外在單耐SM菌株中各發(fā)現(xiàn)1株33A-G+463C-T和33A-G+54A-G突變株，對(duì)CAP耐藥無(wú)任何貢獻(xiàn)，因此該基因并不是CM耐藥良好的檢測(cè)指標(biāo)，其基因突變與SM、KAN、CAP單耐及交叉耐藥并無(wú)關(guān)聯(lián)。

eis基因編碼氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶，該基因啟動(dòng)子發(fā)生突變可引起轉(zhuǎn)錄物水平增加，有研究證實(shí)[17]，結(jié)核分枝桿菌中eis啟動(dòng)子G（-14）A突變被認(rèn)為是檢測(cè)KAN中低水平耐藥的較好的靶點(diǎn)，G（-10）A突變與CAP對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)。本研究共發(fā)現(xiàn)4例eis啟動(dòng)子突變，全部出現(xiàn)在KAN耐藥相關(guān)菌株中，其中單耐KAN3例，分別為1例G（-14）A和2例G（-10）A突變，SM+KAN聯(lián)合耐藥發(fā)現(xiàn)1例G（-10）A突變，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與eis啟動(dòng)子CAP耐藥性相關(guān)證據(jù)。

本研究利用全國(guó)多個(gè)?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）來(lái)源的MDR-TB菌株，具有良好的代表性。通過(guò)對(duì)耐藥相關(guān)基因區(qū)域測(cè)序分析，僅發(fā)現(xiàn)rrs基因的530環(huán)區(qū)域和1401位點(diǎn)突變對(duì)于與SM、KAN、CAP交叉耐藥具有關(guān)聯(lián)性，相關(guān)突變位點(diǎn)今后可能成為交叉耐藥潛在分子篩查標(biāo)志，后續(xù)本研究還需要通過(guò)擴(kuò)大檢測(cè)的樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證，用來(lái)發(fā)展結(jié)核分枝桿菌交叉耐藥的快速檢測(cè)方法。