李海燕，翁婷婷，王樂穎，梁春嬋，董琳

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病毒，在嬰幼兒中有較高的發(fā)病率和致死率[1]。其中毛細支氣管炎是RSV感染導致的最常見的下呼吸道感染，占所有毛細支氣管炎住院患兒的50%～80%[2]。根據(jù)病毒G蛋白基因的不同，RSV可分為A、B亞型[3]。不同亞型RSV感染的嬰幼兒毛細支氣管炎的免疫學機制較為復雜，目前尚不明確?，F(xiàn)仍無有效的疫苗和特效治療藥物，只能對癥支持治療。因此需對可能的發(fā)病機制進行深入探討，為臨床干預和治療提供科學依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組學是研究病毒與宿主細胞相互作用的重要手段，為感染性疾病的預防和治療以及揭示疾病的發(fā)病機制提供更多的研究方法[4-6]。目前國內(nèi)尚少見不同亞型RSV感染轉(zhuǎn)錄組學的研究報道，鑒于不同國家人群的遺傳背景不盡相同，有必要對我國不同亞型RSV感染兒童開展轉(zhuǎn)錄組學研究。本項目前期從收集的23個RSV毛細支氣管炎患兒鼻咽分泌物中分離出11個RSV病毒樣品，最終鑒定均是A亞型RSV，同時應用RNA高通量測序方法對A亞型RSV毛細支氣管炎患兒全血基因轉(zhuǎn)錄組學進行分析，并與性別、年齡配對的健康兒童進行對比，篩選差異表達基因（differentially expressed genes, DEGs），進一步分析差異基因表達功能，以期從分子水平了解A亞型RSV感染的宿主遺傳與免疫反應特點，闡明A亞型RSV毛細支氣管炎的潛在發(fā)病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 招募2020年1月1日至2020年12月31日RSV感染的毛細支氣管炎患兒作為病例組。病例組納入標準：①1～24月齡，漢族；②首次出現(xiàn)咳嗽、喘息[符合毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識（2014版）診斷標準]；③鼻咽分泌物免疫熒光檢測RSV陽性。病例組排除標準：①早產(chǎn)，合并慢性肺部疾病、先天性心臟病、免疫缺陷病、神經(jīng)肌肉疾病等其他慢性疾??；②14 d內(nèi)應用過全身糖皮質(zhì)激素治療；③合并呼吸系統(tǒng)其他病毒或細菌感染；④合并其他系統(tǒng)病毒或細菌感染。健康對照組納入標準：①1～24月齡，漢族；②同期在兒童保健科體檢的健康兒童；③既往無喘息病史，1個月內(nèi)無呼吸道感染史。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會批準（編號：LCKY2019-148），所有研究對象監(jiān)護人知情同意。

1.2 標本采集、RSV病毒亞型鑒定、RNA提取 標本采集：入院當天采集毛細支氣管炎患兒鼻咽分泌物1 mL置于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，應用直接免疫熒光法篩查RSV抗原；健康兒童于就診時采血，RSV陽性患兒在入院48 h內(nèi)采集外周靜脈血1 mL置于EDTA抗凝管，均置于-80 ℃冰箱保存，用于全血白細胞分離和RNA提取。

RSV病毒亞型鑒定：提取病毒總RNA并反轉(zhuǎn)錄，利用Nest-PCR法擴增目的基因，凝膠電泳初步鑒定RSV亞型；同時把剩余RNA送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行反轉(zhuǎn)錄、擴增目的基因、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過條帶回收、測序分析、序列比對等流程進一步明確鑒定RSV為A或B亞型。

外周血白細胞RNA提取：紅細胞裂解液裂解全血中的紅細胞，加入適量TRIzol裂解細胞，按照操作說明提取總RNA；取2 μL樣品于核酸蛋白檢測儀上測OD260和OD280值；剩余RNA用于建庫測序。

1.3 RNA測序、測序數(shù)據(jù)前期處理 將檢測合格的RNA樣品送至上海浦東解碼生命科學研究院利用磁珠富集mRNA，并將mRNA片段化，加入隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，最后利用核酸外切酶、核酸聚合酶進行末端修復，末端添加PolyA，加測序接頭后進行PCR擴增，完成cDNA文庫制備。將質(zhì)量檢測合格的cDNA文庫用Illumina高通量測序平臺進行測序，最終獲得原始測序數(shù)據(jù)。

通過對原始下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估、去除低質(zhì)量序列和接頭污染等質(zhì)控和預處理過程，得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)用于下游分析。同時使用DEseq2軟件包對測序數(shù)據(jù)進行標準化，并進行二維主成分分析（principal component analysis, PCA）和樣本間的層次聚類分析，觀察病例組和對照組之間的相似性和差異。

1.4 DEGs篩選 通過三種R軟件包（DESeq2、edgeR、limma）進行病例組和對照組之間基因表達差異分析，并將FDR值≤0.05且差異倍數(shù)（fold change, FC）絕對值≥2作為DEGs的篩選條件。最終將三種R包同時篩選出的DEGs用于后續(xù)分析，并使用R包ggplot2將最終篩選的DEGs繪制成可視化火山圖。

1.5 功能富集分析 利用R包clusterProfiler中的enrichGO模塊基于基因本體論（gene ontology,GO）對差異基因進行生物學功能富集分析，以校正后P值≤0.05作為閾值篩選出顯著富集的通路。同時利用Metascape在線工具基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclo-pedia of Genes and Genomes, KEGG）數(shù)據(jù)庫對DEGs進行信號通路富集分析，以校正后P值≤0.05作為閾值篩選出顯著富集的通路。

1.6 蛋白相互作用（p r o t e i n-p r o t e i n interaction，PPI）網(wǎng)絡分析、關鍵模塊鑒定、高風險關鍵基因（Hub基因）篩選 通過STRING數(shù)據(jù)庫（https∶//cn.string-db.org/）預測DEGs的蛋白相互作用關系，在Cytoscape中可視化PPI網(wǎng)絡，利用通過MCODE插件對整個PPI網(wǎng)絡進行聚類分析，篩選出差異顯著的核心模塊。同時分別使用Cytoscape中的插件“Cytohubba”和“CytoNCA”獲取高風險Hub基因。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 本研究所涉及的統(tǒng)計學檢驗均由R軟件（v4.1.0）各種分析包及在線分析工具完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV亞型鑒定 通過對23個RSV毛細支氣管炎患兒鼻咽分泌物中分離出的RSV病毒樣品進行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、擴增目的基因、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有11個樣本擴增出RSV病毒特異性片段，約499 bp。通過條帶回收、測序分析、序列比對等流程，11個RSV病毒樣品全為A亞型（見圖1）。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RSV亞型

2.2 RNA測序數(shù)據(jù)質(zhì)控及樣本聚類分析 對11個鑒定出RSV亞型的患兒全血樣品以及10個健康對照提取RNA進行RNA測序，通過對原始數(shù)據(jù)質(zhì)控分析，發(fā)現(xiàn)有1例編號為3的患兒測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較差，因此排除該病例，最終得到10例患兒和10例健康對照的RNA測序數(shù)據(jù)。同時利用PCA的方法對測序數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示A亞型RSV感染的病例組與健康對照組的表達數(shù)據(jù)具有明顯的差異性，兩個主成分對數(shù)據(jù)差異的貢獻度達到51.6%（見圖2A）。樣本的聚類分析結(jié)果也顯示出病例組與健康對照組形成了兩個明顯不同的簇，進一步反映了這兩組樣品的差異性（見圖2B）。

圖2 樣本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制分析

2.3 篩選DEGs 將FDR≤0.05且|FC|≥2作為DEGs的篩選閾值，利用三種差異表達分析的R包（DESeq2、edgeR、limma）對病例組和對照組之間進行基因表達差異分析。結(jié)果如圖3A所示，DESeq2包篩選出648個DEGs，edgeR包篩選出610個DEGs，limma包篩選出318個DEGs。為了進一步篩選出可靠的DEGs，我們從三種方法中同時鑒定出286個DEGs，火山圖顯示有166個基因上調(diào)，120個基因下調(diào)，并用于后續(xù)的功能分析（見圖3B）。

圖3 DEGs篩選

2.4 差異基因的GO和KEGG富集分析 對286個DEGs進行功能注釋和通路富集分析，GO功能富集顯示DEGs主要參與過氧化氫代謝過程、細胞對生物刺激的應激反應、維生素D受體信號通路、氧氣轉(zhuǎn)運、受體信號活性的調(diào)控等生物學過程（見圖4A）。KEGG通路富集分析顯示DEGs顯著富集在免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號、適應性免疫系統(tǒng)、中性粒細胞脫粒、淋巴細胞與非淋巴細胞免疫調(diào)控互作、細胞循環(huán)等與免疫反應有關的信號通路（見圖4B）。

圖4 DEGs功能富集分析

2.5 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及篩選核心子網(wǎng)絡 將286個DEGs導入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，并利用Cytoscape軟件可視化與分析，得到239個節(jié)點（Node）和662條線（Edge）的互作網(wǎng)絡（見圖5A）。然后使用MCODE對整個網(wǎng)絡進行聚類分析，以K-core值為3作為閾值，最終篩選到4個關鍵的PPI模塊，這些模塊內(nèi)的基因主要涉及細胞循環(huán)、病毒蛋白與細胞因子及受體的相互作用、淋巴細胞與非淋巴細胞的免疫調(diào)控互作、激酶級聯(lián)反應等生物學免疫相關過程（見圖5B）。

圖5 PPI網(wǎng)絡篩選

2.6 與A亞型RSV感染相關的Hub基因篩選 利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件中MCC算法從上述的PPI網(wǎng)絡中篩選出排名前15位的節(jié)點基因（見圖6A）。同樣采用CytoNCA插件中的Degree算法從PPI網(wǎng)絡中篩選出排名前15位的節(jié)點基因（見圖6B）。最終將兩種算法共同篩選到的11個基因作為潛在的Hub基因，即RRM2、BUB1B、BUB1、MCM10、CDC45、MKI67、ASPM、NCAPG、NUSAP1、ESPL1、CDT1基因（見圖6C）。

3 討論

毛細支氣管炎是嬰幼兒常見的下呼吸道感染，常發(fā)生于2歲以內(nèi)[7]。其中RSV是毛細支氣管炎最常見病原。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序已初步應用于RSV

毛細支氣管炎的發(fā)病機制及抗感染藥物的篩選研究，并預測與發(fā)病密切相關的Hub基因，從而有助于RSV感染的臨床干預和治療[4-6]。BUCASAS等[5]應用RNA測序方法檢測了21例RSV毛細支氣管炎患兒和37例健康兒童全血轉(zhuǎn)錄組，結(jié)果顯示RSV毛細支氣管炎患兒的固有免疫反應基因，尤其是干擾素信號通路廣泛激活，而與抗原遞呈相關的轉(zhuǎn)錄表達下調(diào)。翁婷婷等[4]利用22例RSV毛細支氣管炎患兒的全血RNA測序數(shù)據(jù)，通過構(gòu)建加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡最終識別與RSV毛細支氣管炎密切相關的Hub基因模塊及Hub基因。另外不同亞型RSV毛細支氣管炎的轉(zhuǎn)錄組學研究在國外也有被報道。有研究應用微陣列芯片分析方法對不同RSV亞型和基因型毛細支氣管炎患兒全血轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)與B亞型感染者相比，A亞型感染患兒干擾素、炎癥及中性粒細胞相關基因表達明顯上調(diào)[6]。然而，目前國內(nèi)尚未見不同亞型RSV感染兒童全血轉(zhuǎn)錄組學的研究報道，鑒于不同國家和種族人群的遺傳背景不盡相同，因此，本研究進行了A亞型RSV毛細支氣管炎兒童轉(zhuǎn)錄組學分析。

本項目通過高通量RNA測序技術，發(fā)現(xiàn)A亞型RSV毛細支氣管炎的患兒和健康對照組存在286個DEGs，其中IL10、CCL2、MUC1等細胞因子已被報道參與RSV感染后的固有免疫反應[8-9]，另外，SIGLEC1、HMOX-1等DEGs也不同程度參與細胞抗病毒的免疫反應[10-11]。基于GO富集分析和KEGG通路分析，我們發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要參與宿主免疫應答、炎癥反應、代謝調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等生物學過程或信號通路。其中DEGs也參與維生素D受體信號通路和過氧化氫代謝過程等生物學通路，已有研究發(fā)現(xiàn)維生素D具有RSV感染后固有免疫應答的調(diào)控作用[12-13]，RSV感染呼吸道上皮細胞后，過氧化氫代謝過程產(chǎn)生的氧化應激反應具有調(diào)控抗炎基因TLR3表達的作用[14]。另外，這些DEGs也參與到中性粒細胞脫粒的信號通路中，有研究顯示中性粒細胞的激活和脫粒在RSV感染過程具有提高激活標志物基因表達、延長細胞凋亡、病毒清除的作用[15-16]。

多個基因之間的相互作用常常參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，本研究進一步深入分析所有DEGs的PPI網(wǎng)絡，并從中鑒定出4個包含Hub基因的蛋白質(zhì)相互作用模塊。這些核心子網(wǎng)絡的基因主要與細胞循環(huán)、細胞因子-細胞因子受體信號通路、淋巴細胞-非淋巴細胞免疫調(diào)控作用、RAF/MAP激酶級聯(lián)反應等通路有關，其中細胞因子-細胞因子受體信號通路已經(jīng)被大量研究證實與各種免疫細胞相互作用，在病毒感染后發(fā)揮抗感染和保護機體的作用[17-18]。另外有研究發(fā)現(xiàn)Raf/MEK/ERK級聯(lián)反應及MAP激酶的激活可能參與到RSV感染后的炎癥反應、宿主細胞信號的轉(zhuǎn)導等過程[19-21]。因此以上通絡均在RSV感染過程中發(fā)揮重要的作用。通過進一步對PPI模塊的網(wǎng)絡拓撲分析，我們最終確定了11個Hub基因，包括RRM2、BUB1B、BUB1、MCM10、CDC45、MKI67、ASPM、NCAPG、NUSAP1、ESPL1、CDT1。其中RRM2、BUB1B、BUB1、MCM10、MKI67、ASPM、NUSAP1等基因已被報道參與呼吸系統(tǒng)病毒感染或其他系統(tǒng)病毒感染過程，并扮演一定的調(diào)控作用[22-27]，不過其參與RSV感染進程的具體機制需要進一步的探索。

本研究的不足之處是從收集的23個RSV毛細支氣管炎患兒鼻咽分泌物中只分離出11個RSV病毒樣品，而且鑒定都為A亞型RSV，鑒于研究發(fā)現(xiàn)不同亞型RSV感染患兒在臨床表型上的差異，有必要進一步收集B亞型RSV毛細支氣管炎患兒血液樣本，進行轉(zhuǎn)錄組學層面的研究，并與A亞型RSV毛細支氣管炎患兒全血轉(zhuǎn)錄組學進行比較，分析其異同。

綜上所述，本研究通過RNA測序及生物信息學分析手段比較了A亞型RSV毛細支氣管炎與健康兒童之間的基因表達差異，觀察到這些DEGs涉及到多個有意義的生物學過程和通路，并篩選出一批潛在的與A亞型RSV毛細支氣管炎相關的Hub基因，這些信號通路及Hub基因未來可成為A亞型RSV毛細支氣管炎的干預和治療靶點。