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        結(jié)球甘藍(lán)一年兩代繁殖技術(shù)及其在雄性不育轉(zhuǎn)育中的應(yīng)用

        2022-11-03 06:56:54王冬梅高曉旭徐景秀
        中國(guó)蔬菜 2022年10期

        王冬梅 高曉旭 徐景秀 賈 俊

        (1 北京華耐農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司研究中心,北京 102200;2 北京市密云區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站,北京 101500)

        結(jié)球甘藍(lán)(L.var.L.)簡(jiǎn)稱甘藍(lán),是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中能形成葉球的一個(gè)變種,頂芽成球,生長(zhǎng)周期短,產(chǎn)量高,質(zhì)地脆嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,耐貯運(yùn),在我國(guó)種植非常廣泛。甘藍(lán)為兩年生草本植物,需經(jīng)冬季2~3 個(gè)月的綠體低溫春化才能開(kāi)花結(jié)實(shí),繁殖1 代至少需要1 年的時(shí)間,育種周期長(zhǎng),一個(gè)品種的育成一般需要10 年以上,對(duì)甘藍(lán)種業(yè)發(fā)展極為不利。由于甘藍(lán)的胞質(zhì)不育轉(zhuǎn)育簡(jiǎn)單,不育性容易保持,故此項(xiàng)技術(shù)在甘藍(lán)雄性不育系的轉(zhuǎn)育上得到廣泛應(yīng)用(季家磊 等,2016),育成了多個(gè)優(yōu)良甘藍(lán)品種(方智遠(yuǎn) 等,2003;莊木 等,2010;楊麗梅 等,2011)。純合的高代自交系材料轉(zhuǎn)育成雄性不育系又需6~8年的時(shí)間,致使甘藍(lán)品種的育成時(shí)間幾乎增加了一倍(Perez-Prat &van Lookeren Campagne,2002),時(shí)間過(guò)長(zhǎng),亟待尋找可以縮短育種時(shí)間的方法。前人對(duì)蕓薹屬植物通過(guò)春化階段所需要的植株?duì)I養(yǎng)體大小、光照、溫度以及感應(yīng)低溫的時(shí)間已有了較明確的研究結(jié)果(日本農(nóng)山漁村文化協(xié)會(huì),1985;許蕊仙,1986;張雪梅和許蕊仙,1989;余陽(yáng)俊 等,2007),但是缺少綜合考慮甘藍(lán)世代繁殖所需要的條件,獲得甘藍(lán)世代繁殖所需最短時(shí)間的研究。本試驗(yàn)將甘藍(lán)世代繁殖分為3 個(gè)主要階段:綠體階段(發(fā)芽到植株生長(zhǎng)到合適大?。⒋夯介_(kāi)花階段(進(jìn)入春化室到授粉)、成苗階段(授粉到種子發(fā)芽)。探尋每個(gè)階段所需要的最短時(shí)間,以期獲得一種可以實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)一年繁殖兩代的方法,縮短甘藍(lán)的育種周期。由于整個(gè)繁殖世代的甘藍(lán)植株均處于幼苗期,不能進(jìn)行成株期的性狀選擇,因此利用SSR 引物在甘藍(lán)幼苗期進(jìn)行背景選擇(劉基生 等,2014;于海龍,2015),獲取遺傳背景更接近保持系的不育系,作為下一個(gè)世代的回交母本。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)在北京華耐農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司研究中心昌平基地進(jìn)行,參試甘藍(lán)材料亦由該公司提供,4份高代自交系G158、G694、G639、G680;G158胞質(zhì)不育的BC單株15 株,編號(hào)G158MS-1~G158MS-15;G639 胞質(zhì)不育的BC單株9 株,編號(hào)G639MS-1~G639MS-9。其中G158 和G694 耐抽薹性弱,G639 耐抽薹性中等,G680 耐抽薹性強(qiáng)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        以種子成苗為節(jié)點(diǎn),一年分為兩個(gè)周期:夏秋周期,6—11 月;冬春周期,12 月至翌年5 月。對(duì)可縮短生殖周期的2 個(gè)關(guān)鍵因素,即授粉到種子發(fā)芽時(shí)間、春化+開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行篩選試驗(yàn)。

        1.2.1 篩選適宜的胚珠剝?nèi)r(shí)間 為了縮短種子成熟所用的時(shí)間,在種莢中的種子成熟之前,剝?nèi)∨咧橹糜阡佊袦缇鸀V紙(使用無(wú)菌水噴濕)的培養(yǎng)皿中,于培養(yǎng)箱中催芽,溫度控制在25 ℃,光照16 h/黑暗8 h,噴灑無(wú)菌水保濕;待子葉展開(kāi),根系長(zhǎng)度為1.5 cm 左右時(shí),移栽到基質(zhì)中。2020年5 月(冬春周期)選擇4 份材料G158、G694、G639、G680,剝?nèi)∨咧闀r(shí)間分別為蕾期人工授粉后30、35、40、45、50 d;2020 年11 月中旬(夏秋周期)選擇2 份材料G158、G639,剝?nèi)∨咧闀r(shí)間分別為蕾期人工授粉后45、50 d。不設(shè)重復(fù),冬春周期每份材料剝?nèi)∨咧?0~66 個(gè),夏秋周期每份材料剝?nèi)∨咧?00 個(gè)。調(diào)查記錄發(fā)芽數(shù)、授粉至成苗天數(shù)、幼苗生長(zhǎng)情況等,計(jì)算發(fā)芽率。

        1.2.2 篩選適宜的植株大小和春化時(shí)間 夏秋周期,以耐抽薹性不同的G158、G639、G680 為試材,植株大小設(shè)置2 個(gè)水平:7~9 片真葉的小苗和13~15 片真葉的大苗。春化時(shí)間設(shè)置3 個(gè)梯度:50、60、70 d。不設(shè)重復(fù),每處理10 株。2020 年7月中旬放入春化室,最低春化溫度為7 ℃,紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照;春化完成后定植于溫室,前期為了降溫,防止脫春化,溫室溫度白天控制在25 ℃左右,夜間15 ℃左右,并利用日光燈補(bǔ)充光照;10 月中下旬授粉結(jié)籽后,為了保溫,在溫室中搭建拱棚并覆蓋保溫被。

        冬春周期,以G158、G639 為試材,植株大小為7~9 片真葉的小苗,春化時(shí)間設(shè)置5 個(gè)梯度:50、55、60、65、70 d;不設(shè)重復(fù),每處理10 株。2021 年1 月中旬放入春化室,最低春化溫度為4℃,紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED 燈24 h 光照;春化完成后定植于大棚,正常水肥管理。

        調(diào)查記錄抽薹開(kāi)花株數(shù)、抽薹開(kāi)花天數(shù)、植株生長(zhǎng)情況等,計(jì)算抽薹開(kāi)花率、春化+開(kāi)花天數(shù)。

        1.2.3 利用SSR 標(biāo)記選擇回交后代 參試材料 為G158 胞質(zhì)不育的BC單株G158MS-1~G158MS-15,以G158 的相應(yīng)保持系作為對(duì)照;G639 胞質(zhì)不育的BC單 株G639MS-1~G639MS-9,以G639 的相應(yīng)保持系作為對(duì)照。分別取植株的幼嫩葉片,采用改良CTAB 法(Yan et al.,2008)提取DNA,-20 ℃保存。

        選用均勻分布在甘藍(lán)9 條染色體上的擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、擴(kuò)增差異明顯、多態(tài)性好的27 對(duì)EST-SSR 引物,包括NT/Y 2473—2013《結(jié)球甘藍(lán)品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 分子標(biāo)記法》公布的20對(duì)甘藍(lán)核心引物,劉基生等(2014)公布的7 對(duì)EST-SSR 引物,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系10 μL,包含DNA模 板4 μL,10× PCR Buffer(含MgCl)1 μL,10 μmol·L上、下游引物各0.4 μL,dNTP(10 μmol·L)0.2 μL,DNA 聚合酶0.1 μL,ddHO 3.9 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃延伸30 s,32 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,16 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,快速銀染法染色后拍照。

        確定每對(duì)引物在24 個(gè)不育系單株和2 個(gè)保持系中擴(kuò)增的等位變異數(shù),統(tǒng)計(jì)每份樣品等位變異的有無(wú),有記為“1”,無(wú)記為“0”,建立數(shù)據(jù)庫(kù)。利用NTSYSPC 2.10e 軟件,計(jì)算保持系與不育系之間的親緣關(guān)系,采用非加權(quán)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析,構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同胚珠剝?nèi)r(shí)間對(duì)甘藍(lán)成苗的影響

        2.1.1 冬春周期 從表1 可以看出,隨著授粉至剝?nèi)∨咧樘鞌?shù)的增加,4 份甘藍(lán)材料的發(fā)芽率均呈增加趨勢(shì);但不同材料的胚珠適宜剝?nèi)r(shí)間有一定差異,G158 授粉后40 d 的胚珠發(fā)芽率達(dá)到72.73%,G694 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率為70.00%,而G639 和G680 授粉后50 d 的胚珠發(fā)芽率才超過(guò)60%。授粉后30~35 d 的胚珠軟嫩,幼胚很小,未發(fā)育完全,基本不出芽,胚珠很快就褐化死亡,極個(gè)別成苗也發(fā)育畸形;授粉后45~50 d 的胚珠成苗大部分正常,授粉至成苗時(shí)間為50~57 d。表明,冬春周期剝?nèi)∨咧榈淖罴褧r(shí)間為授粉后45~50 d。

        表1 冬春周期不同胚珠剝?nèi)r(shí)間對(duì)甘藍(lán)發(fā)芽率及成苗情況的影響

        2.1.2 夏秋周期 此周期種子成熟時(shí)溫度較低,胚珠發(fā)育需要較長(zhǎng)時(shí)間,G639 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率較低,幼苗長(zhǎng)勢(shì)慢,部分畸形;G158 授粉后45 d 的胚珠發(fā)芽率雖然達(dá)到60.00%,但也明顯低于冬春周期,幼苗長(zhǎng)勢(shì)慢(表2)。表明,夏秋周期剝?nèi)∨咧榈淖罴褧r(shí)間為授粉后50 d,幼苗發(fā)育正常,授粉至成苗時(shí)間為56~58 d。

        表2 夏秋周期不同胚珠剝?nèi)r(shí)間對(duì)甘藍(lán)發(fā)芽率及成苗情況的影響

        2.2 不同植株大小和春化時(shí)間對(duì)甘藍(lán)開(kāi)花的影響

        2.2.1 春化植株大小 從表3 可以看出,春化時(shí)間為50 d 時(shí),由于春化時(shí)間較短,G158 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全,前期死蕾,抽薹開(kāi)花時(shí)間長(zhǎng);而G639、G680 未通過(guò)春化。春化時(shí)間為60 d 時(shí),G158 兩種大小的幼苗都通過(guò)了春化,且抽薹開(kāi)花天數(shù)相近;G639 大苗開(kāi)花情況較小苗好,但是都可以正常授粉得到種子,抽薹開(kāi)花天數(shù)接近;G680 基本未通過(guò)春化。春化時(shí)間為70 d 時(shí),G158和G639 兩種大小的幼苗都通過(guò)了春化,抽薹開(kāi)花時(shí)間較春化60 d 處理縮短了4~6 d;而G680 兩種大小的幼苗都表現(xiàn)為春化不完全??傮w上講,營(yíng)養(yǎng)體較大的植株并未明顯縮短春化時(shí)間,并且所需抽薹開(kāi)花天數(shù)也與小苗接近,而7~9 片真葉小苗營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)需要40 d 左右,13~15 片真葉大苗營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)需要50 d 左右,所以在以縮短生殖周期為目標(biāo)的宗旨下,宜選擇7~9 片真葉的小苗進(jìn)行春化。

        2.2.2 夏秋周期的春化時(shí)間 從表3 還可以看出,3 種不同耐抽薹類(lèi)型的甘藍(lán)材料存在一個(gè)共同的特點(diǎn):春化的天數(shù)越短,抽薹開(kāi)花所需要的天數(shù)越長(zhǎng),而春化+開(kāi)花的總天數(shù)相差不大,但是春化時(shí)間短,正常抽薹開(kāi)花率低,所以在保證正常抽薹開(kāi)花總時(shí)間最短的情況下,應(yīng)選擇春化時(shí)間較長(zhǎng)的組合。G158 小苗的最佳春化時(shí)間為60 d,春化+開(kāi)花天數(shù)為90 d;G639 小苗的最佳春化時(shí)間亦為60 d,雖然抽薹枝條少,但可以正常授粉結(jié)籽,春化 +開(kāi)花天數(shù)為92 d;而G680 由于冬性強(qiáng),春化時(shí)間50、60 d 處理的小苗均未通過(guò)春化,春化60 d 處理的大苗僅1 株頂端開(kāi)了幾朵花,春化時(shí)間延長(zhǎng)到70 d 時(shí),小苗30%抽薹,但開(kāi)花少,死蕾嚴(yán)重,大苗80%抽薹,但是枝條少,死蕾嚴(yán)重,所以后期試驗(yàn)中剔除了G680。

        表3 夏秋周期不同植株大小與春化時(shí)間對(duì)甘藍(lán)開(kāi)花的影響

        2.2.3 冬春周期的春化時(shí)間 本周期甘藍(lán)材料的開(kāi)花時(shí)間集中在春季的4 月,相同的春化時(shí)間條件下抽薹開(kāi)花時(shí)間較秋季短,所以春化+開(kāi)花的總時(shí)長(zhǎng)較秋季短,G158 最佳春化時(shí)間為55 d,抽薹開(kāi)花率達(dá)到80%,春化+開(kāi)花天數(shù)為80 d;G639 最佳春化時(shí)間為60 d,抽薹開(kāi)花率70%,可以正常開(kāi)花授粉,春化+開(kāi)花天數(shù)為85 d(表4)。

        表4 冬春周期不同春化時(shí)間對(duì)甘藍(lán)開(kāi)花的影響

        2.3 甘藍(lán)一年繁殖兩代所需時(shí)長(zhǎng)

        由于秋季在綠體階段進(jìn)行了加溫和補(bǔ)光處理,所以兩個(gè)周期中綠體生長(zhǎng)所需時(shí)間無(wú)明顯差別。統(tǒng)計(jì)不同甘藍(lán)材料一年繁殖兩代需要的時(shí)長(zhǎng)可知(表5),G158 夏秋周期完成世代需要186 d,冬春周期需要170 d,總計(jì)356 d,可以實(shí)現(xiàn)一年繁殖兩代;G639 夏秋周期完成世代需要190 d,冬春周期需要181 d,總計(jì)371 d,略長(zhǎng)于1 年的時(shí)間,原因是G639 所需的春化時(shí)間和種子成熟時(shí)間都比較長(zhǎng)。

        表5 不同甘藍(lán)材料不同周期繁殖所需時(shí)間

        2.4 利用SSR 標(biāo)記選擇回交后代

        27 對(duì)SSR 多態(tài)性引物在24 個(gè)不育系單株和2個(gè)保持系中共擴(kuò)增得到63 個(gè)等位變異,每對(duì)引物產(chǎn)生2~5 個(gè)。27 對(duì)引物的多態(tài)性信息含量變化范圍為0.23~0.57,具有較好的鑒別能力,圖1 為部分引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

        圖1 部分引物對(duì)甘藍(lán)不育系的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

        由圖2 可知,26 份材料被明顯分為兩個(gè)類(lèi)群,類(lèi)群Ⅰ中,G158MS-3 和G158MS-8 與G158 相應(yīng)保持系的親緣關(guān)系最近;類(lèi)群Ⅱ中,G639MS-6 和G639MS-7 與G639 相應(yīng)保持系的親緣關(guān)系較近。所以,下一世代中可采用G158MS-3、G158MS-8 和G639MS-6、G639MS-7作為各自保持系的回交母本。

        圖2 甘藍(lán)不育系與回交父本的聚類(lèi)結(jié)果

        3 討論與結(jié)論

        甘藍(lán)通過(guò)春化的最適溫度為0~4 ℃,通過(guò)春化的時(shí)間因品種耐抽薹性不同而差異較大,一般為40~90 d,幼苗越大通過(guò)春化的時(shí)間越短(李文平,2010;王鳳嬌 等,2012)。本試驗(yàn)中進(jìn)行春化的溫度是4~7 ℃,并采用紅藍(lán)光比例為3∶1 的LED燈24 h 補(bǔ)光,除冬性強(qiáng)的甘藍(lán)材料外,基本都能在60 d 之內(nèi)通過(guò)春化;春化時(shí)間對(duì)甘藍(lán)抽薹開(kāi)花的影響要大于幼苗大小的影響,可能是因?yàn)樵诖夯^(guò)程中進(jìn)行了補(bǔ)光處理,幼苗處于持續(xù)生長(zhǎng)的狀態(tài),部分抵消了幼苗大小的影響程度。

        為了縮短種子成熟所需要的時(shí)間,本試驗(yàn)借鑒了胚挽救的方法。前人研究多將胚挽救應(yīng)用于遠(yuǎn)緣雜交獲得種間雜交種中(Zhang et al.,2004;Wen et al.,2008,于海龍,2015);并且在遠(yuǎn)緣雜交中,為了趕在胚珠敗育之前進(jìn)行胚挽救,通常剝?nèi)∨咧榈臅r(shí)間都比較早,一般在授粉后10~15 d,10 d 后有胚萌發(fā),但成活率非常低(于海龍,2015;姜嬌,2018)。此類(lèi)試驗(yàn)中的胚挽救從萌發(fā)到成苗需要經(jīng)過(guò)愈傷階段,而從剝?nèi)∨咧榈匠擅缢枰臅r(shí)間未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)所用材料非遠(yuǎn)緣雜交,胚珠在子房中不會(huì)敗育,為了提高胚珠的成活率,延長(zhǎng)了取胚的時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)授粉后35 d 之前剝?nèi)〉呐咧槌苫盥屎艿停^大部分?jǐn)∮劳?,結(jié)合胚珠發(fā)芽率和縮短成苗時(shí)間兩項(xiàng)因素,最終確定合適的胚珠剝?nèi)r(shí)間為授粉后45~50 d。

        應(yīng)用本試驗(yàn)方法,冬性不是很強(qiáng)的甘藍(lán)材料基本上可以實(shí)現(xiàn)1 年繁殖2 代,但是對(duì)于冬性強(qiáng)的甘藍(lán)材料還需要進(jìn)一步探索可以縮短時(shí)間的步驟,比如采用更低的春化溫度、使用生長(zhǎng)激素等來(lái)縮短春化時(shí)間,采用增加光照強(qiáng)度、延長(zhǎng)光照時(shí)間等來(lái)縮短抽薹開(kāi)花時(shí)間,采用更好的辦法縮短種子成熟所需的時(shí)間等。由于整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中甘藍(lán)植株均處于幼苗期,不能進(jìn)行成株期的性狀選擇,所以本試驗(yàn)方法僅適用于甘藍(lán)雄性不育轉(zhuǎn)育,利用SSR 標(biāo)記選擇時(shí)有明確的選擇方向,并不適用于一般材料的分離純化。如果有條件,可以通過(guò)增加標(biāo)記甚至采取測(cè)序的方法對(duì)幼苗進(jìn)行篩選,對(duì)某些需要加快純化的材料進(jìn)行幼苗期的選擇,獲得所需要的特定材料。

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