胡錦洋，蔣士生*，?？〗?

（湖南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）是一種機(jī)制不明的炎性腸病，極易復(fù)發(fā)，常遷延難愈[1]。 近年來(lái)病理生理學(xué)概念認(rèn)識(shí)到腸道菌群在UC 發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色，對(duì)UC 患者糞便進(jìn)行菌群檢測(cè)證實(shí)存在明顯腸道菌群失調(diào)，其生物多樣性及豐度減少，腸道菌群失調(diào)與腸道炎癥相關(guān)疾病密切相關(guān)[2]。 腸道菌群可通過(guò)Toll 樣受體的介導(dǎo)過(guò)程上調(diào)抗炎細(xì)胞因子和減少促炎細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)控腸道黏膜免疫系統(tǒng)[3]；同時(shí)，正常的腸道菌群可與腸黏膜結(jié)合形成生物屏障，拮抗病原微生物及腸毒素的入侵。 芪連結(jié)腸寧有益氣健脾、清熱祛濕的功效，由全國(guó)名老中醫(yī)藥專家蔣士生教授所創(chuàng)，對(duì)于UC 的治療收效甚好。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)UC 模型大鼠血清及結(jié)腸組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）、核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65、白介素-6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表達(dá)和糞便中腸道菌群多樣性及優(yōu)勢(shì)物種豐度，探討芪連結(jié)腸寧治療UC 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量160～200 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（湘）2021-0008。 飼養(yǎng)條件：晝夜各12 h 明暗交替，室溫22～28 ℃，相對(duì)濕度60%，噪聲≤80 dB。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并完成相關(guān)倫理審查，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查號(hào)：2021-0088。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

芪連結(jié)腸寧組成：黃芪15 g、人參15 g、炒白術(shù)15 g、茯苓15 g，陳皮10 g、黃連10 g、干姜6 g、蒲黃10 g、蒲公英15 g、敗醬草15 g、椿皮10 g、木香10 g、白芍15 g、甘草5 g，藥物浸泡于蒸餾水中40 min，第一煎大火煮沸后，小火煎煮30 min；第二煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，最后將2 次煎煮湯藥混合濃縮制成含生藥2.48 g/mL 的藥液。 所有中藥材均購(gòu)于湖南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，4 ℃冰箱中保存，使用前預(yù)熱。

TRIzol 試劑（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：10296010）；兔IgG-免疫組織化學(xué)試劑盒、HRP-羊抗兔IgG、抗GAPDH 抗體均購(gòu)自武漢博士德公司（批號(hào)分別為15H-1L16F0334、BST15H06A15H65、BST14H06A18G11）；抗NF-κB p65 抗體、抗TLR4 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（批號(hào)分別為ab22048、ab32536）；NF-κB p65、TLR4、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司（批號(hào)分別為55030、55131、53027、55011）；伊紅染液、蘇木素染液均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司（批號(hào)分別為ZH201285、ZH209148）。

超微分光光度儀（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)：Nanodrop200）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX96）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)：RM2235）；BX43 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)：IX73-U）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司，型號(hào)：SpectraMax5）；高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司，型號(hào)：CR22G Ⅱ）。

1.3 動(dòng)物分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、芪連結(jié)腸寧低劑量組、芪連結(jié)腸寧中劑量組及芪連結(jié)腸寧高劑量組，每組8 只。 參照文獻(xiàn)[4]，模型組和芪連結(jié)腸寧各劑量組大鼠均采用5%葡聚糖硫酸鈉 （dextran sulfate sodium, DSS）喂養(yǎng)，即用蒸餾水配制濃度為5%的DSS 溶液，然后放入飲水瓶中自由飲用7 d 以建立UC 大鼠模型。 正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。 造模第7 天隨機(jī)選取2 只大鼠處死，以疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分升高及結(jié)腸黏膜出現(xiàn)損傷表示造模成功[5]。 體質(zhì)量降低率、大便性狀、便血情況根據(jù)各自嚴(yán)重程度，均計(jì)0～4 分，評(píng)分越高，程度越嚴(yán)重。DAI=（體質(zhì)量下降率分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血情況分?jǐn)?shù)）/3。

1.4 干預(yù)方法及DAI 測(cè)定

造模結(jié)束后第2 天起開(kāi)始灌胃給藥。 根據(jù)人臨床用量的等效劑量和動(dòng)物體表面積計(jì)算[6]，芪連結(jié)腸寧低、中、高劑量組每次分別給予含生藥為1.24、2.48、4.96 g/kg 的濃度灌胃，空白組、模型組均以2 mL生理鹽水灌胃，以上各組灌胃均為2 次/d，連續(xù)3周。分別于給藥前及給藥后觀察大鼠體質(zhì)量變化，進(jìn)食、活動(dòng)及糞便情況，根據(jù)體質(zhì)量下降、糞便性狀和隱血情況，計(jì)算DAI。

1.5 HE 染色觀察結(jié)腸組織形態(tài)

末次灌胃結(jié)束后，各組大鼠注射戊巴比妥鈉（0.5 mg/kg）麻醉后斷頸法處死，以生理鹽水行心臟灌注，快速取結(jié)腸組織（8～10 cm），生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，蘇木素、伊紅染色，鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。另一部分結(jié)腸組織液氮速凍，然后于-80 ℃冰箱中保存用于后續(xù)檢測(cè)。

1.6 免疫組織化學(xué)法觀察結(jié)腸組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)情況

取部分結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟水化。3%過(guò)氧化氫溶液封閉10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)后，5% BSA 封閉30 min。 一抗4 ℃（1∶200）孵育過(guò)夜，二抗室溫（1∶200）孵育30 min，DBA顯色。光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 對(duì)NF-κB、TLR4 的平均光密度（optical density,OD）值進(jìn)行半定量分析。

1.7 ELISA 法測(cè)定血清中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α 蛋白含量

行心臟灌注前，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置4 h，4 ℃、3500 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，取上清液。 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品制備、加樣、孵育等操作，加入終止液后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔OD 值。 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品蛋白水平。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4、NFκB p65、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá)

采用TRIzol 試劑提取結(jié)腸組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的質(zhì)量和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線60～95 ℃測(cè)溶解曲線，得出內(nèi)參及各指標(biāo)Ct 值。引物由南京諾唯贊生物科技有限公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。根據(jù)相對(duì)定量法2-ΔΔCt計(jì)算出mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.9 16S rRNA 檢測(cè)大鼠糞便中腸道菌群的多樣性及分布情況

末次灌胃給藥結(jié)束后無(wú)菌采集各組大鼠的直腸段內(nèi)容物于凍存管中，立即存放至液氮中，2 h 后取出干冰運(yùn)送至上海美吉生物醫(yī)藥公司，進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序檢測(cè)。 根據(jù)序列間的相似性（通常為97%）將序列進(jìn)行聚類，分成多個(gè)操作分類單元（operational taxonomic unit, OTU），隨后進(jìn)行物種注釋以簡(jiǎn)化工作量，提高分析的準(zhǔn)確率與效率。 Alpha 多樣性分析反映的是腸道微生物群落豐度和多樣性，主要有Sobs、Chao、Ace、Shannon 及Simpson 5 種衡量指數(shù)。 Sobs、Chao 和Ace 是生態(tài)學(xué)中評(píng)估群落豐度的指數(shù)，Shannon 和Simpson 是用來(lái)估算群落多樣性的指數(shù)[7]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD 法；方差不齊，采用Dunnett’s T3 作組間多重比較。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠DAI 評(píng)分情況

與正常組比較，模型組給藥前后DAI 評(píng)分均明顯升高（P＜0.01）。與給藥前比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組DAI 評(píng)分均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。 給藥后，芪連結(jié)腸寧各劑量組DAI 評(píng)分均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），芪連結(jié)腸寧低劑量組DAI 評(píng)分明顯高于芪連結(jié)腸寧中劑量組（P＜0.05）；芪連結(jié)腸寧高劑量組與芪連結(jié)腸寧低劑量組DAI 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；芪連結(jié)腸寧高劑量組與芪連結(jié)腸寧中劑量組間DAI 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠DAI 評(píng)分比較（±s，分，n=8）

表2 各組大鼠DAI 評(píng)分比較（±s，分，n=8）

注：與正常組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與給藥前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組給藥前0.11±0.16 3.18±0.40▲▲3.21±0.67 3.09±0.59 3.16±0.53給藥后0.09±0.12 2.95±0.23▲▲2.06±0.30*#△1.17±0.27**##1.66±0.25**##

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理改變情況

正常組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列整齊，黏膜上皮組織完整，黏液層正常；模型組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)異常，黏膜表面出現(xiàn)缺損，黏液層部分丟失，大量炎細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，腺體破壞甚至丟失。 芪連結(jié)腸寧各劑量組結(jié)腸組織病理改變不同程度恢復(fù)，黏膜腺體排列較整齊，腸壁基本恢復(fù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE 染色結(jié)果

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織中NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)情況比較

與正常組比較，模型組NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。 與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，芪連結(jié)腸寧高劑量組TLR4 蛋白和芪連結(jié)腸寧低劑量組NF-κB、TLR4 蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）。芪連結(jié)腸寧低劑量組與芪連結(jié)腸寧高劑量組間NFκB p65、TLR4 蛋白表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比較

與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明顯增加（P＜0.01）。 與模型組比較，芪連結(jié)腸寧各劑量組TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，芪連結(jié)腸寧低劑量組、芪連結(jié)腸寧高劑量組TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量均明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。 芪連結(jié)腸寧低劑量組與芪連結(jié)腸寧高劑量組間TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表3。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)法，n=8）

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)情況

與正常組比較，模型組TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。 與模型組比較，芪連結(jié)腸寧低劑量組IL-6 mRNA 和芪連結(jié)腸寧中劑量組、 芪連結(jié)腸寧高劑量組TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），芪連結(jié)腸寧低劑量組TNF-α mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，芪連結(jié)腸寧低劑量組TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 和芪連結(jié)腸寧高劑量組TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。 芪連結(jié)腸寧低劑量組與模型組間TLR4、NF-κB p65 mRNA 表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。芪連結(jié)腸寧高劑量組與芪連結(jié)腸寧中劑量組間IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表4。

2.6 各組大鼠腸道菌群多樣性分析

2.6.1 各組大鼠腸道微生物整體信息及OTU 組成 完成25 個(gè)樣本的多樣性數(shù)據(jù)分析，其中包括正常組、模型組、芪連結(jié)腸寧低劑量組、芪連結(jié)腸寧中劑量組、芪連結(jié)腸寧高劑量組各5 個(gè)樣本，共獲得優(yōu)化序列1 643 539 個(gè)，平均序列長(zhǎng)度417 bp。 OTU 序列相似度為0.97，共獲得876 個(gè)OTU。

2.6.2 Alpha 多樣性分析 此次測(cè)序發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)OTU覆蓋率均大于99.00%以上，說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果代表樣本的真實(shí)情況，可以進(jìn)行下一步分析。與正常組相比，模型組大鼠Sobs、Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)明顯降低（P＜0.01），Simpson 指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，芪連結(jié)腸寧中劑量組Sobs、Ace、Shannon 指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與芪連結(jié)腸寧中劑量組相比，芪連結(jié)腸寧高劑量組Sobs、Ace、Chao 和Shannon 指數(shù)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；芪連結(jié)腸寧低劑量組與芪連結(jié)腸寧中劑量組間Sobs、Chao、Ace、Shannon 及Simpson 指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表5。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比較（±s，pg/mL，n=8）

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、TLR4、NF-κB p65 蛋白含量比較（±s，pg/mL，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組TNF-α 55.51±14.64 369.09±50.80**254.32±30.39#△△110.33±21.59##169.78±26.14##△△IL-6 62.34±11.20 376.36±11.19**322.29±11.83##△△163.28±6.16##224.98±24.39##△TLR4 2.95±1.07 71.76±6.38**55.84±4.61##△△25.19±7.70##42.78±6.18##△NF-κB p65 7.14±1.22 88.23±6.35**60.74±5.68##△△20.32±1.66##41.89±4.51##△△

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)情況比較（±s，n=8）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)情況比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

TNF-α 1.24±0.34 33.32±9.80**44.03±1.06#△△5.78±0.73##14.21±4.18##組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組TLR4 1.13±0.29 6.75±1.10**7.89±0.66△△1.67±0.23##5.03±1.47#△△NF-κB p65 1.09±0.31 33.73±3.80**35.50±2.82△△6.82±0.53##15.68±1.53##△△IL-6 1.04±0.09 31.97±2.15**21.71±1.81##△△6.95±0.35##9.06±0.69##

2.6.3 基于OTU 信息的主坐標(biāo)（principal components analysis, PCoA）及非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling, NMDS）分析 PCoA 得分圖中組成差異的解釋度值PC1、PC2 值分別為27.36%、13.25%，正常組與其他組樣本完全分開(kāi)，表明在經(jīng)過(guò)造模和灌胃干預(yù)之后均對(duì)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。 在NMDS 得分圖中也可看出芪連結(jié)腸寧各劑量組樣本都有不同程度向正常組偏移的趨勢(shì)。 詳見(jiàn)圖3。

2.6.4 基于門(mén)水平下各組大鼠腸道微生物優(yōu)勢(shì)物種占比情況 門(mén)水平下各組大鼠腸道微生物相對(duì)豐度占比前5 的分別是Bacteroidota、Firmicutes、Campilobacterota、Spirochaetota、Desulfobacterota，其余菌門(mén)占據(jù)比例相對(duì)較少。 與正常組相比，模型組Bacteroidota、Campilobacterota 均明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)irmicutes 和Spirochaetota 均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。 與模型組相比，芪連結(jié)腸寧低劑量組和芪連結(jié)腸寧中劑量組Bacteroidota、Campilobacterota 減少（P＜0.05），F(xiàn)irmicutes 及Spirochaetota 明顯增加（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表6、圖4。

表5 各組大鼠腸道微生物Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)比較（±s，n=5）

表5 各組大鼠腸道微生物Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組Sobs 576.4±39.1 436.2±31.51**491.4±20.12#498±57.66#401.8±48.40△△Ace 643.35±61.23 485.99±31.03**540.44±13.84 563.97±65.38#443.64±45.00△△Chao 659.93±77.87 499.74±44.59**548.27±14.23 556.75±73.69 452.30±47.94△△Shannon 4.425±0.294 3.696±0.305**4.065±0.249 4.167±0.254#3.771±0.509△Simpson 0.036±0.020 0.099±0.053*0.061±0.030 0.044±0.014#0.088±0.052

圖3 主坐標(biāo)及非度量多維尺度分析圖

表6 各組大鼠腸道菌群在門(mén)水平前5 的相對(duì)豐度占比情況（±s，%，n=5）

表6 各組大鼠腸道菌群在門(mén)水平前5 的相對(duì)豐度占比情況（±s，%，n=5）

注：表中“0”表示物種豐度極小，可以忽略不計(jì)。 與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組Bacteroidota 39.79±10.82 51.57±7.68**46.98±9.02#44.50±10.51#56.14±8.93 Firmicutes 54.27±10.78 42.74±6.92**48.35±7.91#51.02±10.33#41.74±8.67 Campilobacterota 1.16±0.40 2.80±2.55*0.54±0.60#1.00±0.10 0.23±0.24##Spirochaetota 2.36±1.91 0**1.11±1.63#2.14±2.40 0.01±0.03 Desulfobacterota 0.93±0.46 1.35±0.98 1.04±0.70 0.90±0.43 0.35±0.21

圖4 各組大鼠腸道菌群門(mén)水平群落柱形圖

2.6.5 基于屬水平下各組大鼠腸道微生物優(yōu)勢(shì)物種占比情況 屬水平下各組大鼠腸道微生物相對(duì)豐度占比前5 的分別是Prevotella、norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_f_Lachnospiraceae，其余菌屬占比相對(duì)較少。與正常組相比，模型組Prevotella 明顯增加（P＜0.05），Lactobacillus、norank_f_Muribaculaceae 均明顯減少（P＜0.01）。 與模型組比較，芪連結(jié)腸寧中劑量組Prevotella明顯減少（P＜0.05），norank_f_Muribaculaceae、unclassified_f_Lachnospiraceae 均明顯增加（P＜0.01）。詳見(jiàn)表7、圖5。

3 討論

UC 屬于一種難治性腸道炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與免疫功能、遺傳、環(huán)境、感染等因素有關(guān)[7]。目前，西醫(yī)主要的治療藥物有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但都存在不同程度的缺陷，且停藥或減少用量都有復(fù)發(fā)和加重病情的風(fēng)險(xiǎn)[8]。 相對(duì)而言，中醫(yī)藥治療UC 具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC 的發(fā)病主要以素體脾胃虛弱為基礎(chǔ)，兼之感受外邪或飲食、情志失調(diào)等誘因合而為病，導(dǎo)致濕、熱、瘀、毒、痰等郁結(jié)大腸，氣血凝滯，腸絡(luò)損傷，壅為膿血，遂發(fā)此病[9]。 基于上述理論所創(chuàng)之芪連結(jié)腸寧在臨床觀察中療效顯著[10]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也具有明顯的健脾止瀉和促進(jìn)潰瘍恢復(fù)等作用[11-12]。方中人參、白術(shù)、黃芪、陳皮補(bǔ)氣健脾祛濕，黃連、干姜辛開(kāi)苦降、寒溫并用，蒲黃、蒲公英、敗醬草、椿皮清熱活血、澀腸祛瘀，木香調(diào)理腸道氣機(jī)，白芍酸甘斂陰止痛，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)脾健胃祛濕、活血拔腐生新、收斂固澀止瀉之功效。本實(shí)驗(yàn)中UC 模型大鼠在給予不同劑量芪連結(jié)腸寧灌胃之后，其DAI 評(píng)分均降低，結(jié)腸組織病理改變均有不同程度改善，表明芪連結(jié)腸寧對(duì)于UC 大鼠的結(jié)腸損傷具有一定的修復(fù)作用。

正常的腸道菌群具有抵抗病原微生物入侵、免疫調(diào)節(jié)、促營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)代謝等作用。 在UC 患者腸道中菌群的多樣性會(huì)明顯減少，與健康人群相比，F(xiàn)irmicutes 比例降低，而變形桿菌和Bacteroidota 比例增加[13]。 相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，DSS 誘導(dǎo)的UC模型小鼠Bacteroidota 明顯升高、Firmicutes 明顯減少，經(jīng)治療后可明顯增加Firmicutes 并抑制Bacteroidota[14]。本研究結(jié)果也顯示，模型組大鼠腸道菌群的豐度及多樣性均下降，F(xiàn)irmicutes、Spirochaetota 比例下調(diào)，Bacteroidota、Campilobacterota 及Desulfobacterota 比例增加；而在經(jīng)過(guò)不同劑量的芪連結(jié)腸寧灌胃給藥后，其腸道菌群豐度和多樣性均有不同程度的恢復(fù)，在基于菌群門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)物種的占比與正常組大鼠基本趨于一致，表明芪連結(jié)腸寧對(duì)UC 腸道菌群具有明顯的調(diào)節(jié)作用，且芪連結(jié)腸寧中劑量組具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 腸道菌群紊亂不但表現(xiàn)為有害菌的明顯增加，還可表現(xiàn)為有益菌減少，如Firmicutes 中的Lactobacillus 等。 研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus 可以黏附在腸上皮細(xì)胞上，防止病原體入侵，對(duì)腸黏膜損傷具有保護(hù)作用[15]。Lactobacillus 也可與免疫細(xì)胞直接相互作用，維持胃腸道免疫功能的平衡。 本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Prevotella 豐度明顯增加，而Lactobacillus 豐度明顯降低，提示UC 可能與腸道中益生菌和致病菌的動(dòng)態(tài)平衡被打破密切相關(guān)。 而芪連結(jié)腸寧中劑量組大鼠Prevotella 豐度明顯降低，提示不同劑量的芪連結(jié)腸寧對(duì)于腸道菌群的調(diào)控效果可能不一致，值得進(jìn)一步研究。

表7 各組大鼠腸道菌群在屬水平前5 的相對(duì)豐度占比情況（±s，%，n=5）

表7 各組大鼠腸道菌群在屬水平前5 的相對(duì)豐度占比情況（±s，%，n=5）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與芪連結(jié)腸寧中劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組芪連結(jié)腸寧低劑量組芪連結(jié)腸寧中劑量組芪連結(jié)腸寧高劑量組Prevotella 10.77±8.21 30.19±9.17*20.02±9.76 15.41±6.50#29.43±9.66△norank_f_Muribaculaceae 23.98±6.29 13.79±2.85**17.06±3.45△22.83±4.25##18.39±3.88 Lactobacillus 15.86±3.32 5.69±7.82**6.22±2.96 7.34±4.32 5.19±2.24 Lachnospiraceae_NK4A136_group 5.57±3.52 5.77±1.99 7.96±7.35 6.64±4.09 1.91±2.49 unclassified_f_Lachnospiraceae 3.31±1.27 3.61±1.34 5.12±2.42 7.09±3.84##4.48±1.65

圖5 各組大鼠腸道菌群屬水平群落柱形圖

近年來(lái)，腸道菌群的紊亂與UC 的關(guān)系受到越來(lái)越多的關(guān)注，異常繁殖的腸道致病菌及其衍生代謝物可導(dǎo)致腸道內(nèi)毒素增多，從而加劇UC 的病理進(jìn)展[16]。 細(xì)菌脂多糖是腸道革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，具有致炎作用[17]。 當(dāng)腸道菌群紊亂時(shí)，致病菌與益生菌平衡被打破，脂多糖生成增多，參與腸道炎癥反應(yīng)的激活，從而損傷腸黏膜屏障[18]；而損傷的腸黏膜屏障失去保護(hù)作用，致使腸道中內(nèi)毒素越過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)入外周循環(huán)，導(dǎo)致全身的慢性炎癥狀態(tài)，進(jìn)一步加劇UC[19]。 TLR4/NF-κB 通路的活化是誘發(fā)UC 發(fā)病重要的信號(hào)通路之一[20]。 TLR4 是Toll樣受體的重要亞型，可特異性識(shí)別細(xì)菌脂多糖，參與脂多糖信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)固有免疫炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)宿主防御感染、腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和黏膜先天免疫功能[21]。當(dāng)脂多糖識(shí)別TRL4 后，NF-κB 抑制因子激酶被NFκB 誘導(dǎo)激酶磷酸化，活化的NF-κB 可與基因中κB 序列發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)入核內(nèi)起始轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，加劇腸道炎癥反應(yīng)[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)不同劑量的芪連結(jié)腸寧灌胃給藥后，UC 大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)及血清中TLR4、NFκB p65、IL-6、TNF-α 蛋白含量均不同程度降低，提示芪連結(jié)腸寧能有效抑制UC 大鼠腸道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，芪連結(jié)腸寧能有效改善UC 大鼠結(jié)腸組織病理性損傷，抑制腸道炎癥狀態(tài)，其機(jī)制可能與恢復(fù)腸道菌群豐度及多樣性、調(diào)節(jié)益生菌與致病菌動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而調(diào)控腸道炎癥相關(guān)蛋白通路有關(guān)。 當(dāng)然，此次研究也存在不足，如未檢測(cè)血清中腸道菌群衍生物相關(guān)的內(nèi)毒素含量，未來(lái)還需更加深入的研究。