童匯慧,孫 媛

(1.浙江工商大學(xué),浙江 杭州 310018;2.浙江大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310027)

1 前 言

聚四氟乙烯(PTFE)等不可降解聚合物材料在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了廣泛的研究,其良好的生物穩(wěn)定性和極低的機(jī)體排斥作用[1-2],使得其在永久性的植入體方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在隆鼻假體等領(lǐng)域已取得較多的使用[3-4]。然而,這些材料通常表面能較低、表面疏水性強(qiáng),這使得細(xì)胞在其表面附著及后續(xù)的組織再生等過(guò)程有著不利的作用,并直接影響其在生物體內(nèi)長(zhǎng)期的性能[5]。

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)由細(xì)胞分泌,具有三維網(wǎng)絡(luò),主要由膠原、層粘連蛋白以及糖胺聚糖等構(gòu)成,為細(xì)胞提供可供結(jié)合的位點(diǎn),并調(diào)控其黏附、遷移、增殖、分化等[6-8]。已有大量研究將ECM主要成分,如膠原蛋白[9-10]、層粘連蛋白[1-12]或纖連蛋白[13]等用于材料表面修飾,以改進(jìn)材料表面與細(xì)胞的相互作用。因此,ECM 本身具有作為生物材料應(yīng)用的潛力。ECM 可由組織或器官脫細(xì)胞獲取并用于組織工程等[14]。近年來(lái)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)獲取ECM 得到廣泛的研究,所獲ECM 能有效模擬細(xì)胞微環(huán)境的組成和結(jié)構(gòu)[15]。而且,與通過(guò)組織獲取的ECM 相比,體外細(xì)胞培養(yǎng)獲取的ECM 在可復(fù)合性、仿生結(jié)構(gòu)以及來(lái)源等方面都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Datta等[16]研究發(fā)現(xiàn)具有ECM 涂層的鈦網(wǎng)表現(xiàn)出優(yōu)于純鈦網(wǎng)的堿性磷酸酶活力和鈣磷酸鹽礦化沉積;Liao等[17]在聚己內(nèi)酯微纖維支架材料上接種間充質(zhì)干細(xì)胞,獲得含ECM 的復(fù)合支架,同樣表現(xiàn)出增強(qiáng)的堿性磷酸酶活性和鈣磷酸鹽沉積,且其增強(qiáng)程度與ECM 含量相關(guān),ECM 含量越高,成骨誘導(dǎo)能力越強(qiáng)。細(xì)胞獲取ECM 在體內(nèi)成骨研究也顯示出增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力[18]、增強(qiáng)植入材料表面礦化[19]的能力。Wang等[20-21]通過(guò)高密度、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)軟骨細(xì)胞獲得細(xì)胞膜片,該細(xì)胞薄層既具有細(xì)胞的特點(diǎn),也具有組織的結(jié)構(gòu)特性。脫細(xì)胞后得到的ECM 移植到兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損處后,6周和12周均顯示出良好的修復(fù)效果,有大量新生軟骨組織產(chǎn)生。

然而,當(dāng)ECM 用于一些聚合物材料表面修飾時(shí),在表面上直接制備ECM 表層較為困難,這往往是由于與聚合物親水性差、表面能較低等特性有關(guān)。近年來(lái)聚多巴胺(PDA)的發(fā)展提供了一種新的可能解決方案。PDA 具有生物相容性好[22]、可自聚成膜且?guī)缀蹩梢责じ皆诮^大多數(shù)材料表面[23-24]等特點(diǎn),因此可將PDA 作為結(jié)合劑實(shí)現(xiàn)多種材料表面涂層或薄膜的制備。Wang等[25]利用這一特點(diǎn)將體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞片層直接作為金屬植入體表面涂層,發(fā)現(xiàn)其具有良好的誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的特性。

本研究將體外培養(yǎng)而來(lái)的ECM 通過(guò)PDA 化學(xué)及原位共沉積法在PTFE 表面獲得了ECM 基涂層,并對(duì)其特性和細(xì)胞響應(yīng)性等進(jìn)行了評(píng)估。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 涂層制備

將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)以5×104cells/cm2的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用的無(wú)菌24孔板內(nèi),2 d更換一次培養(yǎng)基,培養(yǎng)7 d,細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)形成細(xì)胞片層。移去培養(yǎng)基,用超純水反復(fù)清洗,清洗過(guò)程中片層自動(dòng)脫落。最后通過(guò)反復(fù)凍融的方法去細(xì)胞:將置于超純水中的細(xì)胞片層放入-80℃快速冷凍30 min,然后取出室溫解凍,解凍后再放入-80℃冷凍30min,如此循環(huán)三次以上。最終獲得的ECM 涂層置于超純水中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在Tris-HCl 緩沖溶液中(p H=8.5)配制2 g/L的鹽酸多巴胺溶液,將PTFE 基板浸泡于此溶液中12 h,制備得到PDA 沉積修飾的PTFE 基板。PDA修飾的基板用去離子水清洗5 次后,將之前獲得的ECM 涂層轉(zhuǎn)移至該基板上并置于37℃的恒溫箱內(nèi)12 h,使ECM 與PDA 之間充分化學(xué)連接與干燥,構(gòu)建得到PDA-ECM 復(fù)合涂層。

2.2 涂層表征

所得的ECM 復(fù)合涂層的表面形貌通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)觀(guān)察,其組成化學(xué)元素通過(guò)能譜分析儀(EDS)分析;涂層的表面粗糙度通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)確定;通過(guò)接觸角測(cè)量?jī)x(OCA20)表征基板表面的潤(rùn)濕特性。利用涂層與基板結(jié)合的剪切強(qiáng)度評(píng)價(jià)兩者的結(jié)合牢固程度:將強(qiáng)力膠帶粘結(jié)于涂層表面,記錄水平方向拉扯膠帶時(shí)應(yīng)力變化進(jìn)而計(jì)算剪切強(qiáng)度[26]。細(xì)胞片層中的殘余細(xì)胞以及膠原蛋白(Col-I)和層粘層蛋白分布等采用DAPI染色和免疫組化熒光染色表征。

2.3 生物學(xué)評(píng)價(jià)

采用鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)在ECM 涂層表面的黏附與增殖評(píng)價(jià)涂層的生物相容性。將BMSC細(xì)胞置于37℃,5%CO2體積分?jǐn)?shù)的具有飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別于1 d、3d和5 d通過(guò)CCK-8試劑盒表征細(xì)胞粘附和增殖狀態(tài)[26]。細(xì)胞的黏附與鋪展情況通過(guò)鈣黃綠素染色后在熒光顯微鏡觀(guān)察評(píng)價(jià)。同時(shí),通過(guò)對(duì)ALP水平的表征評(píng)價(jià)不同表面培養(yǎng)的BMSC的成骨分化情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

生物學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)采用SPSS軟 件中的單因子方差分析方法(one-way ANOVA)和Scheffe’s post hoc方法,對(duì)兩個(gè)組(樣本數(shù)n≥3)的所有平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析,當(dāng)P＜0.05時(shí),數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

如圖1所示,首先對(duì)獲得的細(xì)胞片層進(jìn)行主要成分Col-I和LN 的免疫組化熒光染色。同時(shí),染色用細(xì)胞片層未采取脫細(xì)胞處理,并對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色,方便觀(guān)察基質(zhì)蛋白與細(xì)胞的分布情況。染色結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞外基質(zhì)存在有大量的Col-I和LN,且緊密分布于細(xì)胞周?chē)?/p>

圖1 細(xì)胞片層的熒光顯微照片F(xiàn)ig.1 Fluorescent microscopic micrographs of the cell sheets (a)DAPI; (b)Col-I; (c)LN

如圖2掃描電鏡圖所示,由于PDA 在潮濕狀態(tài)下具有很強(qiáng)的黏附性能,其可以在大部分材料表面形成涂層。PTFE基板表面不平整,存在條形或塊狀起伏。通過(guò)浸泡沉積后,底部因沉積一層PDA 變得致密,起伏溝壑減少,同時(shí)表面還有顆粒狀PDA 堆積。表面固定ECM 后能明顯觀(guān)察到基板表面被具有一定厚度的ECM 所覆蓋,展示的形貌即為ECM平整致密的形貌,表面因干燥過(guò)程出現(xiàn)了一些孔隙。表面的成份變化如表1所示,PTFE基板中主要含有F、C兩種元素,PDA 浸泡處理后O 元素含量的增加驗(yàn)證了PTFE 基板表面沉積了一層PDA。固定ECM 后原基板元素F所占原子比大幅降低,C、O 元素因?yàn)榇罅看嬖谟贓CM,所以含量隨ECM 的固定而增加。

圖2 不同表面的形貌照片 a.PTFE;b.PTFE-PDA;c.PTFE-PDA-ECMFig.2 Surface Morphology of the samples a.PTFE;b.PTFE-PDA;c.PTFE-PDA-ECM

表1 表面成分及接觸角Table 1 Surface composition and contact angles

PDA-ECM 作為復(fù)合涂層對(duì)植入體表面進(jìn)行修飾,其與基板的結(jié)合力也是關(guān)鍵問(wèn)題,如果結(jié)合力弱,涂層處于體液環(huán)境下脫落,就無(wú)法達(dá)到真正的表面改性。因此,采用萬(wàn)能拉伸實(shí)驗(yàn)法對(duì)PDA-ECM 復(fù)合涂層與基板之間的結(jié)合牢固程度進(jìn)行檢測(cè),如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)合涂層與PTFE 基板的剪切強(qiáng)度達(dá)到14.4 MPa,這顯示涂層能夠較為牢固地結(jié)合于PTFE表面。

圖3 PDA-ECM 涂層與PTFE的結(jié)合力Fig.3 Adhesion strength of PDA-ECM coatings on PTFE

親疏水特性影響細(xì)胞在其表面的黏附,并對(duì)后續(xù)發(fā)生的細(xì)胞遷移、增殖和分化具有重要影響。PTFE基板均為疏水基板,將極大地阻礙細(xì)胞粘附增殖。如表1所示,由于PDA 具有良好的親水性,PDA浸泡沉積后的基板親水性均得到了提高,由102°降為42°左右,這也再次證明了PDA 膜的有效沉積。細(xì)胞外基質(zhì)表面暴露有各種親疏水基團(tuán),固定后影響涂層的親疏水性。固定ECM 后的材料表面親水性進(jìn)一步提高,這在一定程度上利于后續(xù)細(xì)胞在基板上的粘附增殖。后期細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)ECM 與細(xì)胞充分接觸,保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

分別將BMSCs接種到PTFE、具有PDA 的基板和具有PDA-ECM 復(fù)合涂層的基板上,培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行鈣黃綠素染色,染色結(jié)果如圖4所示。從圖可見(jiàn),PTFE因強(qiáng)疏水性和化學(xué)惰性,細(xì)胞難以附著于材料表面,黏附數(shù)量很少;PDA修飾后基板生物相容性提高,表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量的增加和細(xì)胞鋪展的改善;PDA-ECM 固定后細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)更為顯著改善,且細(xì)胞形態(tài)較多呈現(xiàn)為梭形。通過(guò)兩組基板的對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn),PDA 和PDAECM 賦予了基板更優(yōu)異的生物相容性,尤其是ECM 因其豐富的成分和識(shí)別位點(diǎn)有利于細(xì)胞鋪展。

圖4 不同表面的BMSCs細(xì)胞形態(tài)Fig.4 BMSCs cells morphology on the surfaces (a)PTFE; (b)PTFE-PDA; (c)PTFE-PDA-ECM

圖5為采用CCK-8 法定量檢測(cè)BMSCs在的黏附增殖的結(jié)果。依次在細(xì)胞接種后的第1、3、5 d進(jìn)行測(cè)定。1 d數(shù)據(jù)可視作BMSCs的黏附情況,表面改性后基板的細(xì)胞黏附數(shù)量增加,與鈣黃綠素結(jié)果一致。3、5 d數(shù)據(jù)視作細(xì)胞增殖情況,PDA-ECM 涂層增殖明顯優(yōu)于PDA,PDA 組在后期增殖速率減慢,證明ECM 在促進(jìn)細(xì)胞的黏附增殖上發(fā)揮了更長(zhǎng)期、更關(guān)鍵的作用,可以顯著改善細(xì)胞材料表面的行為。

圖5 不同表面的BMSCs細(xì)胞增殖Fig.5 BMSCs proliferation on the surfaces

堿性磷酸酶(ALP)是成骨分化的早期指標(biāo)。如圖6所示,ALP結(jié)果顯示,PTFE表面因其具有極強(qiáng)的生物惰性而不利于細(xì)胞生長(zhǎng),OD 數(shù)據(jù)也能觀(guān)察到增殖速率幾乎為零,其ALP 數(shù)據(jù)顯示為負(fù)數(shù),不具備分析意義。而經(jīng)過(guò)PDA 或PDA-ECM 修飾后,ALP 活力相較于純基板得到了提高,而且PDA 組與PDA-ECM組的ALP活力無(wú)明顯差異。但是,這一指標(biāo)只能反應(yīng)所附著的細(xì)胞的活性,無(wú)法反應(yīng)所附著細(xì)胞量的多少。進(jìn)一步結(jié)合圖5的細(xì)胞黏附數(shù)據(jù)綜合考量,可以發(fā)現(xiàn)PDA-ECM 涂層能促進(jìn)細(xì)胞附著、鋪展良好并增殖的同時(shí),又能起到良好的促成骨分化作用,具有較好的綜合性能。

圖6 不同表面培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞的ALP水平Fig.6 ALP Activities of BMSCs cells on the surfaces

4 結(jié) 論

通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)、循環(huán)冷凍脫細(xì)胞處理以及PDA 原位共沉積,能夠有效地在PTFE基板表面構(gòu)建出PDA-ECM 基復(fù)合涂層,涂層與PTFE 基板的剝離剪切力達(dá)到14.4 MPa,顯示出其能牢固地結(jié)合于PTFE表面。復(fù)合涂層的表面細(xì)胞相容性得到了顯著提升,間充質(zhì)干細(xì)胞在其表面的附著及增殖情況均優(yōu)于未改性的PTFE基板。細(xì)胞形態(tài)良好,并顯示出更高的堿性磷酸酶水平。鑒于PDA 與聚合物反應(yīng)的普適性很強(qiáng),這種方法可以有效地在不同種類(lèi)聚合物基板表面沉積ECM 基復(fù)合涂層,進(jìn)而顯著提高其表面的細(xì)胞響應(yīng)性,提升表面與組織細(xì)胞相互作用的性能。