馬譽生，張文萍，明瑞光

（1.福建農林大學生命科學學院，福州 350002；2.福建農林大學海峽聯合研究院基因組與生物技術中心，福州 350002；3.伊利諾伊大學厄巴納香檳分校植物生物學系，美國 伊利諾伊州厄巴納 61801）

轉座子（transposon）是動植物基因組的重要組成成分[1]，是基因組演化過程中不可忽視的一部分[2]，它們可以通過復制或移位從基因組的一個位點轉移至另一個位點[3]，從而造成基因組重排，并對基因組大小、染色體結構和附近基因的表達水平等有著不同程度的影響[4]。轉座子的含量和種類在不同的生物基因組中存在較大的差異，根據其轉座的不同機制，大致可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大類[5]。ClassⅠ型轉座子以RNA為中間媒介進行轉座，可以自身合成逆轉錄酶然后將其本身反轉錄為cDNA，以“復制-粘貼”的形式整合到另一個位點，由于其逆轉錄的特性又被稱為逆轉座子（retrotransposon）[6]。ClassⅡ型轉座子以DNA為中間媒介進行轉座，與ClassⅠ型不同的是此類轉座子在轉座酶的作用下從原位點直接切除并重新整合至新位點，以“剪切-粘貼”的形式進行轉座，因此也被稱為DNA轉座子（DNA transposon）[7]。

微型反向重復轉座元件MITEs屬于ClassⅡ型DNA轉座子中的TIR類轉座子，不具備編碼轉座酶的能力，屬于非自主型轉座元件（non-autonomous transposable elements）[5]。此類基因組元件首先在植物中發(fā)現[8]，并在后續(xù)的研究中發(fā)現廣泛存在于各種生物體基因組中，包括脊椎動物[9]，無脊椎動物[10]，真菌[11]以及病毒[12]。通常MITEs轉座子具有以下典型特征：①轉座子兩端為末端反向互補的重復序列（terminal inverted repeat,TIR）；②在轉座子TIR外兩側為具有正向重復的靶位點重復序列（target site duplication,TSD）；③中間為無編碼能力的序列，該序列中AT含量較高，有形成二級結構的趨勢；④完整片段長度較短，一般在50～800 bp之間[13]。MITEs轉座子通過借助與其TIR序列高度相似的對應自主轉座子編碼的轉座酶進行轉座，但其拷貝數通常高于其對應的自主轉座子[5]。

MITEs轉座子在植物基因組中的頻繁轉座以及高拷貝數等特性對其宿主基因組結構多樣性（如等位基因多態(tài)性）有著至關重要的影響，甚至影響宿主相關基因的表達從而影響表型[14]。這種現象在桑葚（Morus notabilis）[15]、葡萄（Vitis viniferaL.）[16]、胡蘿卜（Daucus carota）[17]和小麥（Triticum-Aegilopsgroup）[18]等多種植物基因組中都有報道，說明了MITEs的存在及轉座活動對宿主影響的普遍性。植物MITEs轉座子數據庫P-MITE于2014年建立并投入使用[19]，該數據庫整理了一些植物基因組中MITEs轉座子的初步鑒定和分類結果，是植物基因組MITEs研究過程中一個良好的參考平臺，由該數據庫統(tǒng)計結果（表1）可知，總體上MITEs轉座子在各植物基因組中具有較高的拷貝數和含量。

表1 MITEs轉座子在植物基因組中的含量[19]Table 1 MITEs content in plant genomes[19]

紅毛丹（Nephelium lappaceumLinn）屬于無患子科熱帶水果，其果肉、種子和樹干等都具有很高的應用價值，如果肉可做成果醬，樹干可用于建筑材料，種仁油可制成肥皂和蠟燭，因此具有極大的商業(yè)價值[20]。紅毛丹高質量基因組的公布，為紅毛丹功能基因組學及基因組演化方面的研究提供了良好的數據基礎[21]，而轉座子存在于幾乎所有的真核生物基因組中，并對其宿主基因組演化、基因表達調控及表型可塑性有著不可忽視的影響[13,22-23]，在紅毛丹中還沒有對MITEs轉座子進行過系統(tǒng)的鑒定和分析，由此本研究利用紅毛丹全基因組數據來鑒定、分類并注釋紅毛丹基因組中的MITEs轉座子，以期完善紅毛丹基因組的注釋并促進其轉座子的研究，為紅毛丹基因組演化和相關基因功能方面的分析提供關鍵的數據依據。

1 材料和方法

1.1 紅毛丹基因組中MITEs轉座子的鑒定與注釋

本實驗室前期已經完成紅毛丹基因組組裝及相關基因注釋[21]，選用MITE-Tracker軟件[24]對紅毛丹基因組中的MITEs轉座子進行搜尋，設置參數為‘-tsd_min_len 2-tsd_max_len 10-mite_min_len 50-mite_max_len 650’，MITE-Tracker對基因組中具有MITEs轉座子結構且滿足參數條件的序列提取出來并聚類為不同的家族，由于目前沒有軟件可以精確辨認所有MITEs轉座子的邊界，因此后續(xù)需要提取出每個家族成員的序列，對每個家族運用MUSCLE-3.7[25]軟件進行多序列比對，對邊界有缺失的序列擴展前后50 bp，再提取出對應的序列重新進行多序列比對，運用BioEdit-7.0.9.0[26]軟件對所得的各家族序列TIR末端進行人工矯正，并按照所總結的MITEs轉座子結構匯總表對各個家族進行超家族分類注釋（表2），最后運用卷積神經網絡深度學習軟件DeepTE[27]對注釋結果及MITEs序列進行修改驗證。運用DAMBE-7軟件[28]計算每個MITEs超家族的一致序列（consensus sequence）。完成轉座子注釋后，計算鑒定出的MITEs序列中腺嘌呤脫氧核糖核酸和胸腺嘧啶脫氧核糖核酸（A和T）的比例，并統(tǒng)計每個超家族在紅毛丹基因組中所占的比例。

表2 MITEs轉座子超家族分類標準Table 2 Classification criteria for MITEs superfamilies

1.2 MITEs轉座子各家族進化樹的構建

對各家族的一致序列進行多序列比對后，利用MEGA-X[29]軟件構建各個家族代表序列的neighbor-joining進化樹，校驗Bootstrap參數設置為1 000次，用iTOL（https://itol.embl.de/）在線軟件對進化樹運行結果進行注釋及可視化。

1.3 MITEs轉座子插入時間的估算

選取K2P模型（Kimura 2 parameter distances）計算每個MITEs拷貝的插入時間[30]，從而了解MITEs轉座子在紅毛丹基因組中的擴增情況。首先使用R語言程序包ape（http://ape-package.ird.fr/），結合公式K=-1/2ln(1-2p-q)-1/4ln(1-2q)（q代表顛換位點所占比例，p代表轉換位點所占比例）計算每個MITEs完整拷貝與相應超家族一致序列（假定祖先序列）之間的遺傳距離，然后運用公式T=K/2r（K為完整拷貝MITEs序列與一致序列之間的遺傳距離，r為核苷酸位點替換速率）[31]計算每個轉座子的插入時間，在本研究中采用1.38×10-8作為核苷酸位點替換速率。

1.4 MITEs轉座子插入位置及密度分布分析

利用軟件MITE-Tracker所產生的MITEs轉座子注釋文件，結合紅毛丹基因組注釋文件中各元素的長度、位置和正反鏈等信息，統(tǒng)計每個轉座子在基因組中的位置，主要對以下位置的插入進行統(tǒng)計：基因5′端（5 kb以內）、基因3′端（5 kb以內）和基因（內含子和外顯子），若MITEs序列任意位點的坐標在上述區(qū)域坐標之內，則統(tǒng)計一次插入，最后將所有轉座子的插入位置信息及插入次數進行整合。獲得紅毛丹基因和MITEs轉座子在基因組中的坐標信息后，利用R語言程序包gtrellis（https://www.statmethods.net/advgraphs/trellis.html）繪制基因和轉座子在紅毛丹各染色體上的密度分布圖，通過比較分析MITEs轉座子在紅毛丹染色體上的插入分布模式。

1.5 MITEs轉座子在基因附近的插入偏好性分析

提取紅毛丹基因組注釋文件中每個基因的坐標和距離紅毛丹基因5′端和3′端5 kb以內的MITEs的相關注釋信息，分別劃分為10個區(qū)段（每個區(qū)段長500 bp），共計20個區(qū)段，按照與基因末端坐標由遠到近的距離依次統(tǒng)計各區(qū)段中MITEs轉座子的插入次數，對數據進行可視化從而分析轉座子的分布情況與基因距離之間的關系。

1.6 MITEs轉座子插入的基因功能富集分析

使用R語言程序包ClusterProfile V3.8（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）對MITEs轉座子鄰近的基因進行GO富集分析，將得到的結果按分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組成（CC）3部分分類，取最顯著的前20個term進行展示比較，然后對MITEs轉座子鄰近的基因進KEGG富集分析，取最顯著的前20個term進行展示比較。

2 結果與分析

2.1 紅毛丹基因組中MITEs轉座子的鑒定及分類

本研究共鑒定出MITEs轉座子完整拷貝588條，全長325 kb，大約占紅毛丹全基因組總長（328 Mb）的0.10%，占紅毛丹轉座子總長度（131.95 Mb）的0.25%，與其他植物基因組中MITEs的占比相比，其含量相對較低。對邊界不完整的MITEs拷貝進行人工矯正（圖1），根據MITEs轉座子結構匯總表的分類標準對軟件MITE-Traker所生成的所有家族進行分類。經反復比對及RepeatMasker中重復序列數據庫和DeepTE軟件訓練模型進行深度學習驗證，得到紅毛丹基因組中MITEs轉座子的超家族：PIF/Harbinger、Mutator、Ac-mMITE、hAT和Ginger，其余無法分類的轉座子歸為Unknown（UN）。各個超家族在紅毛丹基因組MITEs轉座子總量中所占的比例差異較大（表3），這可能與不同MITEs轉座子所對應的自主轉座子的拷貝量和活性相關，其中最大的兩個超家族為PIF/Harbinger和Mutator，分別有362條和108條完整拷貝，在紅毛丹基因組MITEs中的占比分別為64.87%和19.35%，最小的超家族為Ac-mMITE，只有10條完整拷貝，占比為1.80%。

表3 紅毛丹基因組中MITEs超家族統(tǒng)計Table 3 Statistics of superfamilies of MITEs in rambutan genome

圖1 MITEs轉座子手工矯正TIR序列對比圖Figure 1 Comparison plots for correction of MITEs TIR sequence

2.2 紅毛丹基因組中MITEs轉座子的AT含量

紅毛丹基因組中MITEs在總體上AT堿基含量的占比為70.63%，其中AT堿基含量比例最高的超家族為Ac-mMITE（78.22%），其次為PIF/Harbinger超家族（76.00%），因此這兩種超家族結構穩(wěn)定性較低，形成二級結構的趨勢較高（表4），有利于轉座活動。AT堿基數含量較低的超家族為Ginger（37.98%），遠遠低于總體水平，因此這類超家族形成二級結構的趨勢較低。

表4 紅毛丹基因組中MITEs轉座子AT堿基含量統(tǒng)計Table 4 Statistics on AT bases content of MITEs in rambutan genome

2.3 紅毛丹基因組中MITEs的插入時間

紅毛丹基因組中MITEs轉座子共經歷了5次轉座“爆發(fā)”（圖2），其中最早的一次“爆發(fā)”大約發(fā)生于17～18百萬年之前，規(guī)模最小，參與的超家族僅有hAT和PIF/Harbinger兩種；最近一次的轉座“爆發(fā)”則發(fā)生于1～2百萬年之前，MITEs插入數量僅次于規(guī)模最大的一次，有將近80個MITEs轉座子參與其中，包括Ginger、hAT、Mutator和PIF/Harbinger超家族；規(guī)模最大的一次轉座“爆發(fā)”發(fā)生于4～5百萬年之前，超過80個MITEs轉座子參與，雖然此次轉座“爆發(fā)”事件規(guī)模最大，但參與其中的超家族組成卻較為簡單，只有Mutator和PIF/Harbinger兩種超家族。值得注意的是，在轉座子的各個插入時期中幾乎每個時期都有超家族PIF/Harbinger的參與，并且在各個時期MITEs的含量上幾乎占據主導地位，而Ac-mMITE只參與到少數幾個時期的轉座事件中且所占比例極小，這與前文中對各個轉座子含量分析的結果相一致。

圖2 紅毛丹基因組中MITEs轉座子插入時間Figure 2 The insertion time of MITEs in rambutan genome

2.4 紅毛丹基因組MITEs各家族演化樹分析

在系統(tǒng)發(fā)育演化樹中（圖3），隸屬于同一個超家族的各個亞家族一般具有很近的演化關系，總體上各家族具有較好的聚類效果，這從側面反映了本研究中所應用的MITEs轉座子分類方法的準確率較高。從演化樹的分支數來看，PIF/Harbinger超家族的亞家族數最多，主要分為4個類群，這與該超家族作為轉座“爆發(fā)”事件的主要參與者經歷了多輪擴增有關，其次為Mutator，主要分為2個類群，亞家族最少的超家族為Ac-mMITE和Ginger，這些結果也與它們在紅毛丹基因組中含量的高低順序及轉座“爆發(fā)”事件參與度相一致。未被鑒定出的4個超家族（unknown）中F20、F24、F28和F29分別與PIF/Harbinger、Mutaor、Ginger和hAT超家族具有較近的演化關系，但由于在基因組演化過程中這幾個超家族典型的結構完整性已經缺失，無法根據其TIR和TSD序列判斷其超家族的類型。

圖3 MITEs轉座子各家族進化樹Figure 3 Phylogenetic tree of MITEs families

2.5 MITEs轉座子插入位置及插入密度分布分析

MITEs轉座子在紅毛丹基因組各個位置上的分布顯示出了較大的差異，在基因5′端（5′-flank）和基因3′端（3′-flank）的插入數量最多，分別為136個和137個，說明MITEs轉座子的插入主要分布在紅毛丹基因兩端的位置，且兩端插入數量基本持平（表5）。紅毛丹基因（gene）內部插入的MITEs總數為35個，其中插入內含子（intron）的MITEs數為35個，插入外顯子（exon）的MITEs數為2個，其中有2個MITEs轉座子插入區(qū)域橫跨相鄰的外顯子和內含子區(qū)段。分析紅毛丹基因組中MITEs轉座子和基因的分布密度（圖4），發(fā)現MITEs轉座子在紅毛丹各條染色體上的總體插入比較分散，每條染色體上都有一定數量的插入，但是密度相對較低。MITEs轉座子在基因分布較多的區(qū)域密度相對較高，說明在紅毛丹基因組中該類轉座子具有插入到基因密度較高區(qū)域的趨勢。

表5 紅毛丹基因組中MITEs轉座子插入分布Table 5 Insertion distribution of MITEs in rambutan genome

圖4 基因和MITEs轉座子插入密度分布的比較Figure 4 Comparison of density distribution between genes and MITEs

2.6 MITEs轉座子在基因附近插入偏好性分析

由紅毛丹基因組中MITEs轉座子在基因附近插入位置的分布（圖5）可知，MITEs轉座子在基因兩端分布較多。在距離紅毛丹基因5′端5 kb范圍內，-500～0區(qū)段MITEs轉座子插入次數只有12次，隨著與基因的距離越來越遠，在-2 000～-1 501區(qū)段插入次數達到峰值，有34次轉座子的插入，隨后隨著距離增加插入次數逐漸減少。在距離紅毛丹基因3′端5 kb范圍內，0～500區(qū)段MITEs轉座子插入次數為0，隨著與基因距離越來越遠次數逐漸增加，在3 501～4 000區(qū)段MITEs插入次數達到峰值，有27次轉座子的插入，隨后插入數逐漸減少。綜上，在基因兩側5 kb范圍以內，MITEs轉座子插入偏好的情況為，距離基因兩側最近的區(qū)段，MITEs轉座子的插入數最少，隨著距離增加在某一區(qū)段MITEs轉座子的插入偏好會達到峰值，然后又繼續(xù)減少，在總體趨勢上呈現出5 kb以內從離基因較遠的某一點開始，距離基因越近，MITEs插入偏好性越低的分布模式，說明距離基因較近的區(qū)域，MITEs的轉座活動受到了明顯的抑制。

圖5 MITEs轉座子在基因附近的分布情況Figure 5 Distribution of MITEs near the genes

2.7 MITEs轉座子關聯基因的功能富集分析

在MITEs插入到內部的基因中，有4個含有GO編號（圖6），基因編號（表6）分別為：Nl01g01800、Nl01g10720、Nl01g15070和Nl10g00860，這些基因主要參與硫代葡萄糖苷的代謝及生物合成過程（GO:0019757和GO:0019758）、葡糖異硫氰酸鹽的代謝及生物合成過程（GO:0019760和GO:0019761）和S-糖苷的代謝及生物合成過程（GO:0016143和GO:0016144）。分子功能方面，這些基因與各種蛋白復合物的結合相關（GO:0005488、GO:0005515、GO:0008017、GO:0008092、GO:0015631、GO:0032403、GO:0044877和GO:0051011），其次為酶活性功能相關基因（GO:0003824、GO:0016853、GO:0016866和GO:0050486），而這些功能對于相關活性物質的代謝及生物合成過程至關重要。在KEGG富集結果中（圖6），這些基因（表6）主要富集在次級代謝物生物合成、角質、軟木脂蠟質的生物合成、N端多糖的生物合成和硫代葡萄糖苷的生物合成等方面，這些代謝相關通路與上述GO生物過程和分子功能富集結果基本一致。

圖6 MITEs轉座子插入內部基因功能富集分析結果Figure 6 Gene functional enrichment of inside inserted gene

在MITEs插入到5′端5kb范圍內的基因中，有2個含有GO編號（圖7），基因編號（表6）分別為：N101g14070和N101g01800，這些基因主要參與生物 體 生 殖（GO:0000003、GO:0022414和 GO:0044702）及發(fā)育（GO:0032502、GO:0044767、GO:0009790和GO:0010154等）的相關過程。分子功能方面，這些基因與各種復合物的結合相關（GO:0000166、GO:0005515、GO:0005524和 GO:0008092等），這些功能是生物體生殖發(fā)育過程中必不可少的關鍵要素。在KEGG富集結果中（圖7），這些基因（表6）主要富集在次級代謝物的生物合成、類苯基丙烷的生物合成、氮代謝和氨基酸的生物合成等方面，是生物生殖和發(fā)育過程中必不可少的環(huán)節(jié)。

表6 MITEs關聯基因NR注釋結果Table 6 NR annotation of MITEs inserted genes

圖7 MITEs轉座子插入5'端側翼區(qū)的基因功能富集分析結果Figure 7 Gene functional enrichment of 5'-flank inserted gene

3 討論

轉座子最初由巴巴拉·邁克林托克于20世紀40年代在玉米（Zea mays）的第9條染色體中發(fā)現[32]，然而在很長一段時間里轉座子這類重復序列被認為是“垃圾基因”，直到近二十年來隨著全基因組測序技術的蓬勃發(fā)展為各個物種中轉座子的全面鑒定、分類及注釋帶來了先決條件，越來越多的轉座子結構、功能和應用方面的謎題被逐漸揭開[33-34]，這時人們才發(fā)現轉座子對染色體結構[35]、基因組重排[36]、基因組大小[37]、新基因的形成[38]以及基因表達調控[39]等方面都有著較為顯著的影響。

本研究中，MITEs屬于非自主型轉座子，必須依賴與其同源的自主轉座子編碼的轉座酶進行移位，再插入到基因組的其他位點，因此自主轉座子的活性及編碼序列完整性決定了其同源MITEs轉座子的轉座效率及拷貝量。由于轉座子受到選擇壓力，根據轉座子的發(fā)展史，自主轉座元件的活性及結構完整性在基因組演化過程中可能會隨著時間發(fā)生消退，隨后其對應的非自主轉座元件拷貝數也開始逐漸減少[40]，紅毛丹中MITEs的含量相對較低，這可能與其基因組中自主DNA轉座子的活性[5]和其在雙子葉基因組三倍化事件之后沒有再發(fā)生過另外的全基因組復制事件有關[21]。在所有MITEs超家族中，PIF/Harbinger的相對含量占據主導地位且在各個MITEs的轉座“爆發(fā)”時期貢獻度最高，而AcmMITE相對含量最低且在MITEs的轉座“爆發(fā)”的各個時期貢獻度最低，因此可以推測PIF/Harbinger的自主轉座子在近期轉座子擴增的過程中仍具有較高的活性和結構完整性，而超家族Ac-mMITE的擴增活性最低，其大部分同源的自主轉座子可能已經失去活性及結構完整性。另外，MITEs轉座“爆發(fā)”事件在一定程度上可以反映植物基因組演化歷史中的重要事件，并且在宿主基因組可塑性和轉錄應答的改變上可能有一定的貢獻[41]，比如Chen J.等在水稻的重組近交系中研究由轉座元件爆發(fā)所產生的基因組多樣性現象時發(fā)現Ping/mPing轉座子會影響其宿主基因組的多態(tài)性[35]，說明轉座子對基因組的演化具有重要意義。由此可見，MITEs轉座子在紅毛丹基因組中的轉座活動必然會對基因組結構和演化活動造成一定的影響。

在MITEs插入內部的基因功能富集分析中，MITEs插入到某些通路相關基因的內部會改變該基因的結構，從而最終影響到通路本身，甚至改變宿主的某些性狀，Wei L.等在水稻的赤霉素及油菜素甾醇合成途徑中發(fā)現，如果該通路的關鍵基因有MITEs的插入會影響其旗葉夾角和水稻株高等相關性狀[42]。在蔬菜和水果中有大量以葡萄糖苷形式存在的非揮發(fā)性風味前體物質，是蔬菜水果增香的重要大分子[43]，而MITEs轉座子在這些化合物通路相關基因的插入可能會改變葡萄糖苷、葡糖異硫氰酸鹽和S-糖苷的代謝及生物合成相關基因的編碼序列，最終對紅毛丹相關風味等重要農藝性狀造成影響。在MITEs插入到5′端基因的功能富集分析中，有兩個基因主要與生物體的生殖發(fā)育等過程相關，而基因5′端是基因順式調控元件所在的區(qū)域，MITEs轉座子在這些區(qū)域的插入可能會對紅毛丹生殖發(fā)育相關的表型造成影響，如Y.Lee等在玉米中研究一種轉座子監(jiān)督機制保護雄性玉米植株生育能力的過程中發(fā)現，轉座子的轉座活動會增加基因組的不穩(wěn)定性，從而可能產生雄性不育的表型[44]。在MITEs插入位置分析中，插入到基因內部的MITEs比例很低，其中大多數MITEs插入到了內含子當中，會在被插入基因的結構上產生一定程度的改變，甚至影響可變剪切，少數MITEs插入到了外顯子中，在這些基因的功能方面可能會造成直接影響。

MITEs在紅毛丹基因組中插入密度與基因分布密度具有較高的相關性，而且大量MITEs插入到了紅毛丹基因的5′端和3′端附近，這種大量在基因附近的轉座活動可能會在基因表達調控網絡的水平上對基因功能產生影響，最終可能改變宿主表型，產生表型可塑性的改變，如E.Butelli等在血橙的表型研究中發(fā)現當Copia-like反轉座子插入Ruby基因編碼區(qū)上游并受到一定寒冷誘導時，會使其產生紅色果肉的表型[45]。同樣，紅毛丹中MITEs轉座子在這些區(qū)域的轉座事件可能在轉錄和后轉錄水平上對其基因的表達調控有一定的影響，至于影響水平的高低，是否會改變相關的性狀，需要后續(xù)對其進行更加詳細的分析和實驗驗證，Chen L.等學者在菠蘿基因組及其馴化過程的研究中發(fā)現，MITEs轉座子在菠蘿基因附近的插入位置具有高度多樣性，推測這一現象在菠蘿馴化過程中可能會通過體細胞突變作為菠蘿新性狀形成的主要來源之一[46]。隨著越來越多MITEs轉座子的鑒定及相關分析的細化，MITEs在其宿主基因組的演化及相關性狀的多樣性上所扮演的角色會逐漸明朗，對這些信息及相關效應的充分利用可以為其宿主基因組演化及性狀改良等方面的研究帶來更多的途徑。