曾 益，孫藝秋，何夢(mèng)雪，殷中瓊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)飼料全面禁止添加抗生素的大環(huán)境下，替代抗生素類飼料添加劑（如植物提取物等）是畜禽營(yíng)養(yǎng)的重要研究方向。萬(wàn)壽菊（Tagetes erectaL.）作為菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，除具有一定的觀賞價(jià)值外，還因其含有黃酮、葉黃素等多種生物活性物質(zhì)而具有藥用價(jià)值，故也是飼料添加劑的選擇之一[1-2]。目前，萬(wàn)壽菊主要采集部位為花，常用于葉黃素的提取，其莖葉卻往往被當(dāng)做廢棄物，未得到充分的利用。萬(wàn)壽菊莖葉中黃酮類化合物不僅可以顯著增加肉雞飼料效率及平均日增重[3]，還能在肉雞生產(chǎn)中能夠發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用[4-6]。我們前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，萬(wàn)壽莖葉醇提物能夠有效降低LPS致炎小鼠肝和肺的臟器指數(shù)，維持血液的穩(wěn)定，下調(diào)血清中促炎因子的含量和提高抗炎因子水平，從而起到抗炎活性；王金等[8]從萬(wàn)壽菊莖葉中提取得到了3種黃酮類化合物，均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。已有研究表明，萬(wàn)壽菊莖葉可用于肉牛飼養(yǎng)[9]，但有關(guān)萬(wàn)壽菊莖葉及其提取物在家禽領(lǐng)域的研究在國(guó)內(nèi)外均未有報(bào)道。本試驗(yàn)以萬(wàn)壽菊莖葉提取物作為試驗(yàn)對(duì)象，研究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)指標(biāo)、免疫功能以及血液相關(guān)指標(biāo)等方面的影響，為其在雞飼料添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為萬(wàn)壽菊莖葉提取物，由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司采用超聲波提取法提取，以70%乙醇為提取液，料液比為1:30，超聲溫度為70℃、一共提取2次，每次提取1 h。經(jīng)過(guò)抽濾、合并濾液，再將濾液減壓濃縮后，放于50℃烘箱干燥至恒重，得萬(wàn)壽菊莖葉浸膏。提取物為粉狀的萬(wàn)壽菊莖葉浸膏，總黃酮含量為13.29%。ELISA IL-1試劑盒、ELISA IL-1β試劑盒、ELISA IL-6試劑盒、ELISA IL-8試劑盒、ELISA IL-10試劑盒、ELISA IgM試劑盒、ELISA IgG試劑盒、ELISA IgA試劑盒，均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

15日齡健康青腳麻雞240只，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)低、中、高劑量組在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加400、800和1 200 mg/kg萬(wàn)壽菊莖葉提取物，試驗(yàn)期28 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧以玉米豆粕為主原料，依據(jù)我國(guó)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)定制配方，日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Diet Ingredient and Nutrient Concentration

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在成都市金深港農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司下屬肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期為2021年8月21日至9月12日，試驗(yàn)肉雞采用3層雞籠飼養(yǎng)，上下交錯(cuò)排列，飼喂顆粒飼料，定時(shí)上料，自由采食和飲水，晝夜不間斷光照，雞舍第1周溫度調(diào)控在35℃，其后每周下降2℃，直至溫度降至25℃，相對(duì)濕度保持在45%～55%，雞舍定期開(kāi)展帶雞消毒，飼養(yǎng)管理按照成都市金深港農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司的肉雞飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5 樣品采集

于開(kāi)始飼喂前以及飼喂后第7、14、21和28天空腹稱重，再于試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行放血屠宰（屠宰前1 d晚上開(kāi)始禁食，大約禁食12 h），頸靜脈采血，3 000 r/min離心10 min分離血清后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ∠旅庖咂鞴伲ㄐ叵?、脾臟、法氏囊）去除脂肪組織后稱重。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生產(chǎn)性能的測(cè)定

記錄正式飼喂第0、7、14、21和28天肉雞的體重，以每個(gè)重復(fù)組為單位稱量體重，計(jì)算平均日增重。

1.6.2 免疫相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.6.2.1 免疫器官指數(shù)

免疫器官指數(shù)/（g·kg-1）=免疫器官重量×100/肉雞活體重。

1.6.2.2 免疫球蛋白的測(cè)定

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）。將標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各待測(cè)因子在血清樣品中的濃度。

1.6.2.3 血清細(xì)胞因子的測(cè)定

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和PGE2吸光度（OD值）。將標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各待測(cè)因子在血清樣品中的濃度。

1.7 萬(wàn)壽菊莖葉提取物成分分析

為探究萬(wàn)壽菊莖葉提取物中所含有效成分，按照各類天然藥物有效成分的常規(guī)檢識(shí)方法[10-11]，對(duì)萬(wàn)壽菊莖葉提取物進(jìn)行有效成分檢測(cè)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用student’s-test檢驗(yàn)顯著性分析，P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01視為差異極顯著，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可得，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組在飼喂的前14 d，其肉雞體重雖有增長(zhǎng)，但差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)飼喂21～28 d后，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞的體重與對(duì)照組相比，顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），其平均日增重也顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。其余各組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組能提高肉雞的生產(chǎn)性能。

表2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞體重的影響Table 2 Effects of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on body weight of broilers g

2.2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞免疫器官的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組能顯著提高肉雞脾臟的免疫器官指數(shù)（P＜0.05），其余劑量組對(duì)脾臟的免疫器官指數(shù)無(wú)顯著的影響（P＞0.05）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組對(duì)法氏囊和胸腺的免疫器官指數(shù)有提高效果，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞免疫器官的影響Table 3 Effect of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on organ indexes of broilers

2.3 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清中免疫球蛋白的影響

肉雞血清中免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

圖1 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清中免疫球蛋白的影響Figure 1 Effect of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on serum immunoglobulin in broilers

與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞血清中IgG含量顯著上升（P＜0.05），其余各劑量組雖有所上升，但差異不顯著（P＞0.05）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組與對(duì)照組相比，其肉雞血清中IgM含量顯著上升（P＜0.05），其余各劑量組肉雞上升差異不顯著（P＞0.05）。萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組肉雞血清中IgA含量與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

萬(wàn)壽菊莖葉提取物低、中、高劑量組間的IgA和IgG均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；但與萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物低劑量組肉雞血清中IgM含量極顯著下降（P＜0.01），萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞血清中IgM含量顯著下降（P＜0.05）。

2.4 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響

肉雞血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉低、中劑量組肉雞血清中PGE2的含量顯著下降（P＜0.05），其高劑量組肉雞血清中PGE2含量則極顯著下降（P＜0.01）；萬(wàn)壽菊莖葉提取物高劑量組肉雞血清中IL-1β的含量與對(duì)照組相比，也顯著下降（P＜0.05），而其余各劑量組肉雞血清中IL-1β與對(duì)照組相比雖有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，萬(wàn)壽菊莖葉中劑量組肉雞血清中的IL-10含量與對(duì)照組相比，顯著上升（P＜0.05）；其余各劑量組肉雞血清中IL-10含量雖有所上升，但差異不顯著（P＞0.05），萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量對(duì)肉雞血清中IL-1、IL-6和IL-8含量無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖2 萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)肉雞血清細(xì)胞因子的影響Figure 2 Effects of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.on serum cytokines in broilers

萬(wàn)壽菊莖葉提取物低、中、高劑量組間的IL-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和PGE2均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 萬(wàn)壽菊莖葉提取物的有效成分檢測(cè)

萬(wàn)壽菊莖葉提取物中主要包含的有效成分為黃酮類化合物和酚類化合物，見(jiàn)表4。

表4 萬(wàn)壽菊莖葉提取物的有效成分檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of active component detection of the extract of stem and leaves of Tagetes erecta L.

3 討論與小結(jié)

現(xiàn)有研究表明植物黃酮可以提升肉雞的生產(chǎn)性能，鄭偉等[12]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加0.05%沙棘葉黃酮后可使肉雞的平均增重相對(duì)于對(duì)照組提升8.28%，李莉等[13]發(fā)現(xiàn)飼料中添加萬(wàn)壽菊黃酮可以顯著提升4～6周齡的黃羽肉雞平均日增重。萬(wàn)壽菊是一種常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)作物，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫性能等作用[14-15]。目前，關(guān)于萬(wàn)壽菊莖葉提取物對(duì)家禽的生產(chǎn)性能和免疫系統(tǒng)的影響還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，給予肉雞不同劑量的萬(wàn)壽菊莖葉提取物并檢測(cè)其平均日增重，得到萬(wàn)壽菊莖葉提取物各劑量組均有所提高，其中萬(wàn)壽菊莖葉提取物中劑量組肉雞的平均日增重與對(duì)照組相比，極顯著提高，表明萬(wàn)壽菊莖葉提取物能提高肉雞的生產(chǎn)性能，以中劑量組為最佳，不具備有量效關(guān)系。與萬(wàn)壽菊花提取物以及其他菊科植物相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物同樣能提高肉雞的生產(chǎn)性能[16-19]。植物黃酮具有提升肉雞的生產(chǎn)性能的作用，且在本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)成分分析發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊莖葉提取物中主要含有黃酮類化合物，因此我們推測(cè)萬(wàn)壽菊莖葉提取物中起著提高肉雞生產(chǎn)性能的活性成分可能為黃酮類化合物[20-22]。

免疫器官的發(fā)育狀況及機(jī)能強(qiáng)弱直接決定著禽類的免疫水平。脾是禽類最大的外周免疫器官，參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，其重量的增加可說(shuō)明機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能的增強(qiáng)[23-24]。除免疫器官外，免疫系統(tǒng)中的免疫因子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用。其中免疫球蛋白是能夠決定體液免疫程度的重要因素[25]；免疫球蛋白的表達(dá)水平直接放反映了機(jī)體的抗病能力；免疫球蛋白的表達(dá)水平直接放反映了機(jī)體的抗病能力；細(xì)胞因子則是評(píng)估細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)[26]，其中IL-1、IL-6和IL-8與機(jī)體炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系，IL-10作為一種抗炎因子，可以抑制炎癥的發(fā)生[27]。而PGE2作為一種強(qiáng)烈的血管擴(kuò)張劑，則在炎癥后期大量地表達(dá)。鄭艷等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在雞的日糧中添加青刺果黃酮后，相較于對(duì)照組，其血清中的IgM和IgG的含量顯著增加；朱紅崗等[29]也發(fā)現(xiàn)雞肝散總黃酮可以提升小鼠血清中的IgM的含量。而在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，萬(wàn)壽菊莖葉提取物也能顯著提高肉雞脾臟的免疫器官指數(shù)，并上調(diào)肉雞血清中IgG、IgM的表達(dá)水平，可能是因?yàn)槿f(wàn)壽菊莖葉提取物中的黃酮類物質(zhì)刺激了脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)了免疫球蛋白的產(chǎn)生。同時(shí)萬(wàn)壽菊莖葉提取物顯著上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)水平，顯著降低血清中IL-1β和PGE2的含量。萬(wàn)壽菊莖葉提取物通過(guò)提升血清中的免疫球蛋白的濃度，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，降低了外源物質(zhì)入侵機(jī)體后帶來(lái)的損害，從而降低了機(jī)體炎性反應(yīng)，因此降低了炎性因子的水平，使肉雞消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中用于抵抗疾病的部分減少，從而用于生長(zhǎng)的部分增加，所以提高了動(dòng)物的生產(chǎn)性能[30]。

綜上，萬(wàn)壽菊莖葉提取物能顯著提高肉雞生產(chǎn)性能及其機(jī)體的免疫性能，可作為飼料添加劑應(yīng)用于肉雞日糧中，其最佳用量為800～1 200 mg/kg。