楊玉亮 ，賈奇鋒

(1.山西大同大學(xué) 煤炭工程學(xué)院，山西 大同 037003；2.中國礦業(yè)大學(xué)(北京) 能源與礦業(yè)學(xué)院，北京 100083；3.中國地質(zhì)大學(xué)(北京) 能源學(xué)院，北京 100083)

0 引 言

生物成因煤層氣是煤中大分子有機質(zhì)經(jīng)特定微生物降解轉(zhuǎn)化為可溶性有機質(zhì)[3-5](長鏈脂肪酸、烷烴、低分子量芳烴等)，然后繼續(xù)被降解成乙酸、H2和CO2等小分子，最后被不同產(chǎn)甲烷菌群利用生成甲烷[6-8]。雖然溫度、鹽度、pH值、Eh值和微量元素含量對煤的微生物厭氧降解體系影響已被國內(nèi)外研究學(xué)者所證實[9-11]，但煤階是影響煤生物產(chǎn)氣實驗室研究的前提。STRAPOC等[12]假設(shè)生物CH4的生成潛力與煤階增加之間存在負相關(guān)關(guān)系，他們將這一結(jié)論歸因于高階煤含有較高的芳香烴含量。宋金星等[13]探討了不同煤階煤的顯微組分與生物甲烷代謝之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)煤中H/C比與生物產(chǎn)氣效率具有一致性。WAWRIK等[14]報告稱，生物CH4生成潛力和煤階之間沒有相關(guān)性，并得出結(jié)論認為，煤的活化和較強的微生物群落結(jié)構(gòu)是生物CH4生成的主要因素。

國內(nèi)外學(xué)者對生物成因煤層氣生成的液相成因機理已經(jīng)有了較深入的研究。陳林勇等[15]研究了無煙煤生物產(chǎn)氣不同階段發(fā)酵液中液相產(chǎn)物的變化特征，認為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和長鏈烷烴在煤生物產(chǎn)甲烷過程中發(fā)揮中重要的作用。趙同謙等[16]探討了煤生物產(chǎn)氣過程中有機液相產(chǎn)物的變化特征，得出發(fā)酵液中TOC含量的變化周期與產(chǎn)氣時期具有一致性。XIA等[17]發(fā)現(xiàn)煤樣通過白腐菌預(yù)處理后可增加中間液相有機物(包括二十七烷、乙酸、丁酸、酰胺類等)的生成量，同時水解期明顯縮短。煤制生物甲烷液相成因機理研究中發(fā)酵底物較為單一，對不同煤階煤生物降解過程液相產(chǎn)物對比還沒有形成共識。

微生物吸附是由其表面結(jié)構(gòu)以及物理性質(zhì)決定的[18-19]。微生物因其表面特有的有機大分子結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)、脂多糖等)，使其能吸附于煤表面[20]。同時，煤的多孔結(jié)構(gòu)和粗糙基質(zhì)也有助于微生物的吸附[21]。微生物生物膜是動態(tài)的、復(fù)雜的、非隨機的結(jié)構(gòu)[22-23]，煤與細菌之間的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化需要生物膜，如果生物膜在煤表面形成，它們可能是釋放和轉(zhuǎn)化有機物的宿主生物。有學(xué)者研究結(jié)果表明，表面活性劑可以改變煤顆粒表面性質(zhì)，增加細菌在煤顆粒表面的吸附能力，并促進生物膜的形成，從而利用微生物提高煤層氣產(chǎn)量的關(guān)鍵[24-25]。

基于煤的生物產(chǎn)氣潛力與煤階的耦合關(guān)系，眾多研究均從煤結(jié)構(gòu)的分析角度入手，鮮有關(guān)注不同煤階煤生物產(chǎn)氣過程中發(fā)酵液液相產(chǎn)物變化規(guī)律以及菌群附著特征與甲烷產(chǎn)量之間的協(xié)同效應(yīng)。因此，本文用液相分析結(jié)果與掃描電鏡測試，來反映不同煤階煤樣厭氧生物降解過程中生物甲烷出現(xiàn)差異的可能性原因，為煤的清潔利用提供借鑒。

1 不同煤階煤的生物產(chǎn)氣試驗

1.1 試驗材料

分別在山西麻家梁煤礦、山西沙曲煤礦和河南平頂山煤礦采集新鮮的長焰煤、焦煤和瘦煤作為試驗煤樣，工業(yè)分析和元素分析分別按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進行，測試結(jié)果見表1。試驗前將煤樣放入60 ℃的烘干箱中烘干24 h(為了去除煤樣水分以及殘余氣)，然后將其粉碎至60～80目(0.2～0.3 mm)，并在35 ℃下干燥24 h，密封保存。

表1 煤樣的工業(yè)分析與元素分析

1.2 生物產(chǎn)氣試驗

試驗所用產(chǎn)甲烷菌菌種由各個礦井井口排采水經(jīng)過富集、馴化培養(yǎng)得到。在500 mL錐形瓶中加入15 g煤樣、200 mL水、70 mL培養(yǎng)基和30 mL菌液，營養(yǎng)液具體準(zhǔn)備方式見文獻[26]。

設(shè)置3種煤樣的生物產(chǎn)氣試驗，每組3個平行樣。3組發(fā)酵試驗均在35 ℃下恒溫培養(yǎng)箱中進行，采用排水集氣法每隔5 d進行氣體含量測試，甲烷定量分析使用氣相色譜儀(Agilent 7890GC)。同時采集3種發(fā)酵試驗第0天、第10天、第15天、第20天和產(chǎn)氣終止階段(第30天)的發(fā)酵液，供后續(xù)液相有機物成分測定。

長沙為湖南省省會，位于湖南的東部偏北，坐標(biāo)為 111°53′—114°5′E，27°51′—28°40′N，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，春、夏季冷暖氣流交匯頻繁，容易產(chǎn)生強對流天氣及雷暴活動。長沙地區(qū)年平均氣溫為17.4 ℃，年平均降水總量為 1 475.7 mm，平均降水日數(shù)為 154.7 d，年平均雷暴日為 47.7 d，屬多雷區(qū)。 據(jù)不完全統(tǒng)計，2002—2017年長沙地區(qū)共計發(fā)生雷電災(zāi)害事故1 807起，造成22人死亡，30人受傷，直接經(jīng)濟損失1 584.92萬元。

1.3 有機物成分測定

采用以下GC-MS條件對發(fā)酵液進行分析：美國安捷倫(GC-MS 7890-5977A氣相色譜儀/質(zhì)譜儀)，配有游離脂肪酸相(FFAP)色譜柱(30 m×0.25 μm×0.5 mm)和國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST)2014數(shù)據(jù)庫。測定條件為：載氣為99.999%的高純氦氣，載氣流速為30 mL/min；柱溫采用程序升溫至50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至120 ℃，以5 ℃/min升至170 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。

1.4 掃描電鏡檢測

按照前人的研究進行固定溶液與磷酸緩沖液的配制。掃描電鏡樣品制備：發(fā)酵后煤樣在固定溶液中浸泡2 h，之后用磷酸緩沖液清洗4次，然后進行乙醇梯度脫水：25%、50%、75%、95%乙醇各浸泡十次，每次時間為20～30 min，之后用100%乙醇浸泡3次，每次時間為1 h。最后樣品在35 ℃烘干箱中進行干燥處理。用Edwards S 150B濺射鍍膜機對樣品進行1 min的金濺射，并用捷克Tescan公司VEGA TS 5136 XM掃描電子顯微鏡進行觀測[27]。

100 mL的1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.2)的配制：添加6.8 mL濃度1 mol/L NaH2PO4，用1 mol/L Na2HPO4調(diào)整pH，直到pH為7～7.2，用滅菌好的去離子水至100 mL。

100 mL的固定溶液制備：分別添加50 mL 4%多聚甲醛、8 mL 25%戊二醛、20 mL上述磷酸鈉緩沖液和22 mL滅菌后的去離子水。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物產(chǎn)氣量分析

不同煤階煤的生物產(chǎn)氣累積產(chǎn)氣量、甲烷濃度與甲烷產(chǎn)量進行了研究，結(jié)果如圖1所示。可以看出，生物產(chǎn)氣總量與煤階成反比，煤階越高，生物產(chǎn)氣總量越低，并且低煤階煤的生物甲烷產(chǎn)量明顯高于高煤價煤，說明低階煤更適合作為生物成氣的底物。

圖1 累積產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量變化特征Fig.1 Change characteristics of cumulative biogas and methane production

煤階不同，產(chǎn)氣階段也有所差異。煤階越低，煤的生物產(chǎn)氣3個階段越明顯，第1階段：緩慢增長→快速增長；第2階段：快速增長→緩慢增長；第3階段：緩慢增長→產(chǎn)氣停止。對煤生物成氣有利的第2階段：長焰煤的第2階段是7～22 d，瘦煤的第2階段是15～22 d，相對長焰煤持續(xù)時間較短，焦煤的生物成氣反應(yīng)較為平緩，沒有明顯的大幅上升階段。

2.2 液相產(chǎn)物分析

每組試驗制作5個平行樣，分別在5、15、20和30 d取50 mL發(fā)酵液(充分搖勻后提取)，進行離心處理，離心速度：9 000 r/min，離心機溫度：10 ℃。離心后取上清液進行GC-MS測試，圖2、圖3和圖4所示，表2、表3和表4列舉了對應(yīng)圖中峰號所對應(yīng)的化合物。

1，…，14—峰號圖2 長焰煤厭氧發(fā)酵過程中GC-MS譜圖Fig.2 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for long flame coal

1，…，14—峰號圖3 焦煤厭氧發(fā)酵過程中GC-MS譜圖Fig.3 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for coking coal

1，…，14—峰號圖4 瘦煤生物制氣發(fā)酵液GC-MS譜圖Fig.4 GC-MS chromatogram in process of anaerobic fermentation for lean coal

表2 長焰煤厭氧發(fā)酵過程中GC-MS半定性結(jié)果匯總

長焰煤試驗組試驗開始階段(第0天)就有大分子物質(zhì)存在，與在發(fā)酵第10天化合物含量有較大變化，部分芳香環(huán)和雜環(huán)化合物豐度降低，VFA和甲基化合物等物質(zhì)的豐度升高，如丁酸、戊酸等，而VFA被認為是生物甲烷產(chǎn)生的前提，甲基類物質(zhì)可以通過甲基營養(yǎng)途徑參與成氣，說明該階段的發(fā)酵液具有較大的產(chǎn)氣潛力。在發(fā)酵第15天有新的大分子物質(zhì)產(chǎn)生，如2,4-二叔丁基苯酚(14號峰)等，這可能緣于水解菌的降解。在第20天并未檢測到大量的VFA及低分子化合物，可能由于隨著產(chǎn)甲烷菌群對發(fā)酵環(huán)境逐步適應(yīng)，其活性增強，對VFA等低分子物質(zhì)的消耗速率大于生成速率，并且對比第20天與第15天，所有化合物(包括芳香環(huán)和雜環(huán)化合物)均處于下降狀態(tài)，這一階段微生物降解劇烈，這可能是這個期間出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰的原因，這與Orem等學(xué)者的研究結(jié)果相似[28]。第30天期間化合物豐度出現(xiàn)上升趨勢，但產(chǎn)氣幅度不大，可能是前期部分水解菌活性降低，有機大分子物質(zhì)不能充分被利用。

焦煤試驗組發(fā)酵過程液相產(chǎn)物變化特征基本上與長焰煤組相似，但之間仍有差異，焦煤試驗組第10天，代謝產(chǎn)物中芳香環(huán)和雜環(huán)化合物分子量相對較小，原因是在排除微生物降解發(fā)酵底物的可能性條件下，焦煤較長焰煤變質(zhì)程度大，不易被微生物降解，得到的長鏈烷烴分子量相對較小。在發(fā)酵第15天同時又有大分子物質(zhì)產(chǎn)生，如正二十一烷(10號峰)、正三十烷(13號峰)，并且十九烯(12號峰)豐度增長較大，較長焰煤試驗組，新生成的長鏈烷烴分子量較大，表明微生物已經(jīng)對焦煤進行降解(表3)。

表3 焦煤厭氧發(fā)酵過程中GC-MS半定性結(jié)果

瘦煤發(fā)酵過程液相產(chǎn)物變化特征較長焰煤試驗組、焦煤試驗組有所不同，同樣易揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和甲基化合物等物質(zhì)(丁酸、苯酚、4-甲基戊酸、2-甲基丁酸)在第10天的豐度有所升高(圖4、表4)，但從以后的樣品GC-MS測試結(jié)果來看，部分VFA從生成就無法被充分利用，說明在瘦煤的煤制甲烷試驗過程中菌群活性較長焰煤與焦煤試驗組的要低，從而使得VFA的降解速率小于生成速率，這也是瘦煤試驗組產(chǎn)甲烷量低的原因之一。

表4 瘦煤生物制氣發(fā)酵液GC-MS半定性結(jié)果

前人研究結(jié)果表明，煤層水中或煤的可有機提取物中存在長鏈烷烴、類異戊二烯和多種長鏈脂肪類和飽和烴類化合物(如本研究的二十四烷、二十五烷、二十一烷等)[29]，同時在煤層氣井排采水中檢測到的單甲基烷烴和烷基環(huán)己烷是典型的微生物降解煤的產(chǎn)物[30]，脂肪族化合物和環(huán)狀碳氫化合物可能是煤層水中生物降解脂肪酸等物質(zhì)的結(jié)果[31]。一些研究結(jié)果表明，低成熟度煤中存在低分子量水溶性有機物，在這些研究中，主要的可提取化合物及其濃度取決于煤的成熟度，一些發(fā)酵中間產(chǎn)物(如脂肪酸)具有潛在毒性或抑制甲烷的生成[32]。甲烷生成的抑制可能與通過有機酸中間體的積累降低酸堿度有關(guān)。焦煤試驗組檢測到的脂肪酸(十八酸)豐度較大，可抑制甲烷的生成，這可能是焦煤試驗組相較長焰煤試驗組甲烷產(chǎn)量低的原因之一。同時福莫羅等[29]對低階煤和高階煤的提取物進行的研究表明，在地下煤炭生態(tài)系統(tǒng)中，芳烴的生物降解優(yōu)先于脂肪類物質(zhì)。長焰煤試驗組中多環(huán)芳烴及其功能衍生物(如2,4-二叔丁基苯酚)豐度較焦煤試驗組(如鄰苯二甲酸二正丁酯)和瘦煤試驗組(如苯酚)高的多，更適合微生物降解，產(chǎn)生更多的生物甲烷。

2.3 煤表面菌群吸附特征

為了觀察不同煤階煤發(fā)酵體系中煤樣表面微生物群落和浮游微生物群落的附著規(guī)律，進行了掃描電鏡試驗，結(jié)果如圖5所示。試驗依次從3個階段(第10天、第15天和第20天)概述了菌群的形態(tài)類型、附著方法以及煤表面的變化特征。

圖5 不同煤樣厭氧發(fā)酵過程中煤表面結(jié)構(gòu)變化特征Fig.5 Change characteristics of coal surface structure in process of anaerobic fermentation for different coal samples

第10天，在3種類型煤樣表面均觀察到細胞的存在，但存在的形態(tài)類型不同。長焰煤表面存在球狀細胞(長0～0.8 μm)和桿狀細胞(長1～2 μm)，但主要以球狀為主。焦煤表面存在棒狀的異型體(長0～1.2 μm)和桿狀黏附細胞(長2～3 μm)，分布較單一，沒有出現(xiàn)群居分布。瘦煤表面細胞也由單一球狀(長0～0.8 μm)結(jié)構(gòu)形態(tài)組成。

第15天，長焰煤表面觀察到與第10天相同形態(tài)的細胞，沒有明顯的附著跡象，但數(shù)量增加，偶爾出現(xiàn)菌絲包裹球狀細胞的現(xiàn)象。焦煤在第15天棒狀的異型體細胞密度增加(長0.8～1.2 μm)，同樣也沒有明顯的附著跡象。而在瘦煤表面觀察到一種新的形態(tài)(長2～3 μm)，并對煤樣的黏附性較大，偶爾與球狀細胞相互交融。大體在第15天細胞密度均有所增加，細菌的活性在10～15 d增長較快。

在發(fā)酵末期(第20天)，長焰煤表面細絲狀形態(tài)明顯，但球狀和桿狀細胞密度減少。焦煤表面偶爾能觀察到桿狀粘附細胞，發(fā)酵分泌物分布較大，整體較第15天細胞密度有所減少。最后，焦煤和瘦煤表面均發(fā)現(xiàn)有細胞裂解現(xiàn)象，說明在第20天細菌陸續(xù)死亡，致使發(fā)酵體系開始減弱。

觀察不同天數(shù)下煤樣表面的變化特征，發(fā)現(xiàn)長焰煤表面凹凸不平，粗糙度逐漸增加，側(cè)面反映出長焰煤被菌群充分降解。而焦煤和瘦煤表面發(fā)酵分泌物增多，但表面結(jié)構(gòu)無明顯變化，所以相較于長焰煤，焦煤和瘦煤煤階較高，很難被微生物利用。

一些學(xué)者對煤層微生物群落結(jié)構(gòu)進行了活性監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)相較于煤層水，附著在煤固體上的微生物更多，所以觀察煤表面的菌群分布更能反映煤生物發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。長焰煤試驗組液相產(chǎn)物中生成的VFA較多，對發(fā)酵不利的細菌源Desulfovibrio(脫硫弧菌)和Pseudomonas(假單胞菌)菌為桿狀菌[33]，因此球狀菌可能是對發(fā)酵有利的水解菌與乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，它們較高的吸附率驗證了長煙煤組產(chǎn)甲烷量高的事實[34]，所以在長焰煤試驗組觀察到的菌群分布多為球狀菌。發(fā)酵過程中CO2生成量與液相產(chǎn)物分子量成正比關(guān)系這一結(jié)論已被證實，并且焦煤試驗組生物降解焦煤產(chǎn)生的甲基類物質(zhì)和大分子脂肪烴物質(zhì)豐度較大，因此在焦煤試驗組中可能以還原CO2為代謝途徑的Methanobacterium(甲烷桿菌屬)[35]含量較多，與圖5焦煤試驗組SEM圖像相匹配。瘦煤試驗組甲基類物質(zhì)與VFA含量較豐富，因此與長煙煤組電鏡結(jié)果相似，以球狀菌為主，也可能存在以還原CO2為代謝途徑的Methanobacterium，但兩者相對含量較低，與瘦煤試驗組SEM測試結(jié)果相符，甲烷產(chǎn)量相對較低。由此可以看出，液相產(chǎn)物可以間接表征煤樣表面菌群的吸附特征，為煤制生物甲烷過程中微生物的分布特征研究提供借鑒。

3 結(jié) 論

1)生物產(chǎn)氣總量與煤階成反比，煤階越高，生物產(chǎn)氣總量越低，并且低煤階煤的生物甲烷產(chǎn)量明顯高于高煤價煤，說明低階煤更適合作為碳源供產(chǎn)甲烷菌利用。

2)3個煤階的煤生物產(chǎn)氣過程的第10天有VFA和甲基化合物等物質(zhì)生成，長焰煤試驗組與焦煤試驗組在產(chǎn)氣高峰期(第15天)未檢測到VFA等小分子物質(zhì)存在，并且伴隨有新的大分子物質(zhì)生成，而瘦煤試驗組并未在第15天檢測到VFA，可能歸因于瘦煤試驗組發(fā)酵后期產(chǎn)甲烷菌活性的降低。

3)液相產(chǎn)物可以間接表征煤樣表面菌群的吸附特征。在發(fā)酵第10天，均檢測到菌群細胞的存在，但存在的形態(tài)類型不同；在發(fā)酵第15天，細胞密度均有所增加；在發(fā)酵第20天，長焰煤表面球狀和桿狀細胞密度減少，焦煤和瘦煤表面發(fā)現(xiàn)有細胞裂解現(xiàn)象。

4)長焰煤表面凹凸不平，粗糙度逐漸增加，而焦煤和瘦煤表面結(jié)構(gòu)無明顯變化。