陳崇蓮 戴偉鋒 秦 誼 李寶才 張 敉

昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 昆明 650500

胃黏膜損傷（Gastric mucosal damage）是一系列外源性或內(nèi)源性攻擊因子進(jìn)入胃內(nèi)刺激胃黏膜所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，胃黏膜屏障功能被攻擊因子侵襲及胃腺體結(jié)構(gòu)受到破壞時(shí)可誘發(fā)黏膜損傷。胃黏膜受損時(shí)，胃發(fā)生一定病變?nèi)缥秆住⑽笣?，?dāng)治療不充分時(shí)，胃炎及胃潰瘍往往發(fā)展為胃癌。其中藥物刺激[1～4]、幽門螺旋桿菌感染[5～7]、應(yīng)激創(chuàng)傷[8，9]、抽煙酗酒[10，11]等往往是胃黏膜損傷的主要誘因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示：消化系統(tǒng)疾病致死人群中，因飲酒所致的占21.3%。而全球飲酒者的比例在上升[12，13]。人們飲酒后，酒精首先與胃黏膜接觸，對(duì)胃黏膜病理生理的影響十分顯著[14]。大量文獻(xiàn)研究表明，攝入濃度為14%的乙醇即可破壞胃黏膜屏障，使其形態(tài)與功能發(fā)生改變[15，16]。酒精對(duì)胃黏膜損傷明確，黏膜呈非特異性病變，目前已普遍用作動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于藥理研究，藥效評(píng)估，探討胃黏膜急性損傷的病理生理機(jī)制[17]。

黃腐酸（FA）是腐植酸（HA）[18]中分子量較低，含氧官能團(tuán)較多，水溶性最好的部分，因此也被稱為“藥用黃腐酸”[19]?，F(xiàn)代藥理作用研究表明：黃腐酸具有止瀉[20，21]、抗氧化[22，23]、抗炎[24，25]、抗?jié)僛26～29]等活性。我國河南鞏義制藥廠（現(xiàn)更名為江蘇平光信誼中藥有限公司）率先從煤炭中提取出黃腐酸并制成了口服液，用于治療胃寒、胃痛、胃及十二指腸出血。

為進(jìn)一步探索黃腐酸對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)機(jī)制，本文基于黃腐酸功效，運(yùn)用酒精所致小鼠胃黏膜損傷模型，從產(chǎn)自黑龍江寶清（BQ）、云南彌勒（ML）和建水（JS）3 地褐煤中提取制備黃腐酸，并分析3 地煤樣及黃腐酸的理化性質(zhì)，測定黃腐酸對(duì)胃黏膜損傷中小鼠胃蛋白酶活力的影響，以期為探索黃腐酸保護(hù)胃黏膜機(jī)制提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 材料

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[30]，從產(chǎn)自黑龍江寶清、云南彌勒和建水的褐煤中提取制備了黃腐酸樣品，編號(hào)分別為BQ-FA、ML-FA 和JS-FA。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體重22±2 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于25 ℃環(huán)境中，白天晝夜12 h 交替，給予充足的食物，適應(yīng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)制定的操作原則。

1.2 試劑與儀器

酒精（分析純）、PBS 磷酸緩沖液、超純水、胃蛋白酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）、枸櫞酸鉍鉀膠囊（湖南華納大藥廠股份有限公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）、鑷子、灌胃針、燒杯、電子天平、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、移液槍及槍頭、EP 管。

1.3 實(shí)驗(yàn)溶液的配制

枸櫞酸鉍鉀的配制：本實(shí)驗(yàn)規(guī)格每粒含枸櫞酸鉍鉀0.3 g（相當(dāng)于鉍100 mg）。故取開膠囊殼，將膠囊溶于10 mL 純水中，得到濃度為10 mg/mL的溶液。

黃腐酸樣品的配制：準(zhǔn)確稱取BQ-FA、MLFA、JS-FA 樣品400.00 mg，溶于10.00 mL 純水中，得到40 mg/mL 的母液。

采用灌胃給藥方式，給藥前稱重小鼠，按小鼠體重給藥，所有藥品灌胃時(shí)濃度按1 mL/100 g體重，均為給藥當(dāng)天配制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 煤樣及黃腐酸理化性質(zhì)分析

參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[30]對(duì)煤樣和所提取的黃腐酸進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.4.2 黃腐酸的精制

取型號(hào)為001×7 的陽離子樹脂，用去離子水進(jìn)行浸泡，使其膨脹，待充分膨脹之后，去離子水清洗干凈，把水分濾干，用無水乙醇浸泡大約8 h，濾干乙醇，再用去離子水清洗樹脂中殘留的無水乙醇，直至去離子水無黃色。用樹脂體積2 ～3 倍的氫氧化鈉和鹽酸多次交替浸泡去離子水清洗，直至樹脂呈中性為止，確保樹脂中不含有氯離子。然后稱取黃腐酸溶解在去離子水里，將溶液的pH 值調(diào)節(jié)到5，待溶液充分溶解之后，將其放置到4 ℃的冰箱靜置過夜，約12 h，取出溶液，離心，保留黃腐酸上清液，將上清液循環(huán)上樣，旋蒸濃縮至黏稠狀，將其轉(zhuǎn)移至瓷盤中，再將其放入到冷凍干燥器中冷凍干燥，得到精制黃腐酸。寶清、彌勒、建水3 地的黃腐酸精制方法一致。

1.4.3 胃蛋白酶活力測定

48 只小鼠正常喂食適應(yīng)1 周，隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別為空白對(duì)照組（未用酒精處理，正常組）、模型組（灌胃酒精0.5 mL/100 g）、陽性藥組（灌胃枸櫞酸鉍鉀）、實(shí)驗(yàn)組（灌胃BQ-FA、ML-FA 和JS-FA）。采用灌胃方式，每日9 時(shí)進(jìn)行，陽性藥組每日給予100 mg/kg 枸櫞酸鉍鉀，連續(xù)1 周；實(shí)驗(yàn)組每日分別給予劑量為400 mg/kg 的3 種黃腐酸樣品，連續(xù)1 周；空白對(duì)照組和模型組每日分別給予同等劑量的生理鹽水，連續(xù)1 周。末次給藥前禁食不禁水12 h；第7 天，同上述灌胃后禁水，1 h 后，除空白對(duì)照組予0.5 mL/100 g 生理鹽水外，其余各組小鼠均給予劑量為0.5 mL/100 g的酒精；1 h 后，將所有試驗(yàn)小鼠脫頸處死，剝離胃組織，沿胃大彎將其剖開，用預(yù)冷PBS 磷酸緩沖液清洗胃內(nèi)容物，放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BCA（Bicinchoninic acid）法蛋白定量

1.5.1 組織樣本前處理

取各組小鼠胃組織，胃組織表面的水分用濾紙吸干。稱取各個(gè)組織的相同部分，與PBS 磷酸緩沖液一起勻漿，組織重量（g）：生理鹽水（mL）為1 ∶9，放入3 mm 研磨珠2 顆，4 mm 研磨珠1 顆于研磨儀中4 ℃下研磨40 s 2 次，使組織徹底勻漿化，制成10%的組織勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，于2500 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液備用。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和樣品蛋白濃度的測定

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：BCA 蛋白濃度測定試劑盒中取出蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，用蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至100 μL，使終濃度為0.5 mg/mL。

BCA 工作液配制：根據(jù)樣品數(shù)量，按BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書，取50 體積BCA 試劑A加1 體積BCA 試劑B（50 ∶1）配制適量BCA 工作液，充分混勻。

蛋白濃度測定步驟如下：

a.將標(biāo)準(zhǔn)品按0、2、4、8、12、16 μL 加到96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。

b.加10 μL 小鼠胃組織樣品到96 孔板的樣品孔中，再加10 μL PBS 磷酸緩沖液補(bǔ)足20 μL。

c.各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃放置30 min。

d.用酶標(biāo)儀在562 nm 測定，記錄OD 值。

e.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

1.6 小鼠胃組織中胃蛋白酶活力檢測

本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶活力試劑盒檢測小鼠胃組織中胃蛋白酶活力，具體操作如下：

（1）從-80 ℃冰箱取出小鼠胃組織，解凍平衡至室溫。

（2）從4 ℃冰箱取出胃蛋白酶試劑盒平衡至室溫。

（3）準(zhǔn)確稱取胃組織重量，按胃組織重量（g）∶6 號(hào)勻漿介質(zhì)（胃蛋白酶活力試劑盒所帶試劑）體積（mL）=1 ∶9 的比例，放入3 mm 研磨珠2 顆，4 mm 研磨珠1 顆，4 ℃下于研磨儀中研磨40 s 2 次，使組織徹底勻漿化，制成10%的組織勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，于2500 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液預(yù)試后按以下操作測定胃蛋白酶活力。

（4）設(shè)置測定管和對(duì)照管，酶促反應(yīng)按表1步驟操作。

表1 酶促反應(yīng)操作步驟Tab.1 Operation steps of enzymatic reaction mL

將酶促反應(yīng)所加試劑充分混勻，37 ℃水浴10 min，3500 rpm，離心10 min，取上清液0.3 mL進(jìn)行顯色反應(yīng)，操作步驟見表2。

表2 顯色反應(yīng)操作步驟Tab.2 Operation steps of color reaction mL

將顯色反應(yīng)中所加試劑充分混勻，37 ℃水浴20 min，波長660 nm，光徑1 cm，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度OD 值。

胃蛋白酶活力的計(jì)算公式如下：

組織中胃蛋白酶活力（U/mg prot）=（測定OD值-對(duì)照OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（50 μg/mL）/反應(yīng)時(shí)間（10 min）×（反應(yīng)液總體積/ 取樣量）/ 待測樣本蛋白濃度（mg prot/mL）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)以x±s 的形式表示，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，組間比較用方差分析（LSD 法）。統(tǒng)計(jì)圖使用Graphpad prism 8.0 軟件制作，P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 煤樣及黃腐酸理化性質(zhì)分析

寶清、彌勒和建水褐煤及其所制備黃腐酸的理化性質(zhì)如表3、表4 所示。由統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果可知，3 地褐煤水分、碳含量、黃腐酸得率無顯著性差異（P＞0.05）；而各地褐煤中灰分、總腐植酸含量、游離腐植酸含量、黃腐酸中灰分、精制后黃腐酸灰分存在顯著性差異（P＞0.05）；值得注意的是，3 地黃腐酸精制后的灰分含量比精制前下降明顯。

表3 煤樣理化性質(zhì)分析Tab.3 Analysis of physicochemical properties of coal samples %

表4 黃腐酸理化性質(zhì)分析Tab.4 Analysis of physicochemical properties of fulvic acid

2.2 胃組織中蛋白含量的測定

根據(jù)上海碧云天生物技術(shù)研究所的BCA 蛋白定量試劑盒說明書中的操作步驟，得到蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）方程為：Y=0.6320X+0.1354（R2=0.9927）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得各組10%胃組織勻漿的蛋白含量（表5）。

圖1 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein content

表5 各組小鼠10%胃組織勻漿蛋白含量（n=8）Tab.5 The protein content of 10% gastric homogenate of mice in each group (n=8) mg/mL

2.3 胃組織中胃蛋白酶活力的測定

根據(jù)試劑盒說明，測定了各組胃組織勻漿中的胃蛋白酶活力。由圖2 可知，與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組胃蛋白酶活力顯著升高，陽性藥組和各實(shí)驗(yàn)組均有下降趨勢，且有顯著性差異（P＜0.05），推測黃腐酸發(fā)揮保護(hù)胃黏膜的作用可能與抑制胃蛋白酶活性有關(guān)。JS-FA 組與模型組相比，有下降趨勢，但無顯著性差異，這可能是因?yàn)樘崛〉暮置寒a(chǎn)地不同造成的黃腐酸成分和藥效有一定差異。

圖2 小鼠胃蛋白酶活力測定結(jié)果（n=6）Fig.2 Determination results of pepsin activity in mice (n=6)

3 討論

胃黏膜損傷是侵襲因素與胃黏膜防御能力之間失去平衡導(dǎo)致的結(jié)果[31]。臨床上常以胃蛋白酶活力水平，作為胃粘膜損傷的評(píng)價(jià)指標(biāo)，一般胃蛋白酶活力偏高，則提示胃黏膜發(fā)生了損傷。如前文所述，飲酒是引起胃黏膜損傷最常見的原因[13]。本實(shí)驗(yàn)選取了胃蛋白酶活力作為觀察指標(biāo)，研究酒精誘導(dǎo)型胃黏膜損傷小鼠胃蛋白酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BQ-FA、JS-FA、ML-FA 均可使酒精所致的胃潰瘍小鼠胃蛋白酶活性降低，推斷這可能是黃腐酸保護(hù)胃黏膜功能的作用機(jī)制之一。受試樣品中，BQ-FA 組和ML-FA 組效果較好（P＜0.05）；而JS-FA 組與模型組相比，雖有一定效果但并無顯著性差異（P＞0.05），這可能是提取黃腐酸所用褐煤產(chǎn)地、成煤植物不同，導(dǎo)致黃腐酸呈現(xiàn)的藥理活性并不完全相同。本實(shí)驗(yàn)說明黃腐酸對(duì)酒精型胃黏膜損傷的保護(hù)作用可能與降低胃蛋白酶活力有關(guān)。黃腐酸能降低酒精誘導(dǎo)而升高的胃蛋白酶活力的作用機(jī)制可能與枸櫞酸鉍鉀相似，即黃腐酸能夠在胃黏膜損傷表面或肉芽組織處形成一種堅(jiān)固的保護(hù)性薄膜與胃蛋白酶發(fā)生螯合，使胃蛋白酶失活，隔絕酒精對(duì)胃黏膜的侵蝕作用，阻斷酒精對(duì)胃黏膜的損傷。這種作用機(jī)制也可能與黃腐酸的膠體性質(zhì)息息相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。