徐曉津，房茂勝，繆 楹，黎維勇

精神分裂癥是一種嚴(yán)重慢性精神疾患，主要表現(xiàn)為感知覺、情感和行為異常，與大腦結(jié)構(gòu)異常、遺傳因素、妊娠分娩及環(huán)境影響等有關(guān)[1]。近年來，非典型抗精神病藥物已逐漸成為首選藥物用于各類精神疾病治療，但研究[2-3]表明，利培酮、奧氮平等藥物對患者糖脂代謝、體質(zhì)量及激素水平存在不利影響。布南色林是一種新型治療精神分裂癥藥物，多項臨床研究[4-5]結(jié)果表明，布南色林對精神分裂癥的陽性癥狀和陰性癥狀均有較好療效，且較少出現(xiàn)體質(zhì)量增加、代謝異常等不良反應(yīng)。PI3K/AKT/GSK3β信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展中有重要的調(diào)控作用。該研究將探究布南色林對MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響及其中PI3K/AKT/GSK3β信號通路作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物清潔級SD大鼠48只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量200～240 g，購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2019-0002。

1.2 實(shí)驗材料布南色林片購自日本住友制藥株式會社(國藥準(zhǔn)字：J20170045)；利培酮片購自西安楊森制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字：H20010309)；地卓西平馬來酸鹽(dizeuxipine maleate，MK-801)購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自瑞士Roche公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Bio-Swamp公司；內(nèi)參β-肌動蛋白(β-actin)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylationPI3K，p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)及p-GSK3β蛋白一抗購自美國Abcam公司。動物行為自動跟蹤分析系統(tǒng)(型號：Ethovision 3.0)購于荷蘭Noldus公司；動物行為記錄分析系統(tǒng)(型號：Smart-16)購于西班牙Panlab公司；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(型號：XR-XM101)購于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；全自動生化分析儀(型號：XL-600)購于德國Erba公司；實(shí)時熒光定量PCR儀(型號：CFX Connect)購于美國BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1動物分組、建模與處理 將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組：① 正常組，正常飼養(yǎng)；② 模型組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型；③ 布南色林組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型，灌胃1 mg/kg布南色林，連續(xù)灌胃2周，每日2次；④ 利培酮組，一次性腹腔注射0.6 mg/kg MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥模型，灌胃0.54 mg/kg利培酮，每組12只。MK-801誘導(dǎo)造模后連續(xù)2周監(jiān)測大鼠行為學(xué)變化，選取穩(wěn)定模型大鼠進(jìn)行給藥處理[6]。根據(jù)大鼠與人之間用藥劑量換算公式：大鼠劑量(mg/kg)=6.3×人劑量(mg/kg)，70 kg成人每日利培酮劑量6 mg、布南色林劑量12 mg計算[7]，利培酮組灌胃0.54 mg/kg利培酮，布南色林組灌胃1 mg/kg布南色林。

1.3.2行為學(xué)觀察 給藥結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)觀察。

1.3.2.1刻板行為 參照Sams Dodd刻板行為標(biāo)準(zhǔn)[8]對各組大鼠進(jìn)行評分，分值范圍0～5分；其中幾乎靜止不動評為0分，正常生理活動、偶爾向前運(yùn)動評為1分，活動并伴有反復(fù)向前聞嗅探索為2分，連續(xù)向前聞嗅探索為3分，重復(fù)地?fù)u頭、抬頭或旋轉(zhuǎn)為4分，快速地?fù)u頭、轉(zhuǎn)圈或頭的背腹運(yùn)動為5分。上述評分過程采用雙盲法，取均值為最終結(jié)果。

1.3.2.2曠場實(shí)驗 用一個開口的黑色木箱，長寬高分別為81、81、28 cm，連接動物行為自動跟蹤分析系統(tǒng)和動物行為記錄分析系統(tǒng)，將大鼠輕放入木箱，讓大鼠自由探索3 min，記錄大鼠活動總路程。

1.3.2.3Morris水迷宮實(shí)驗 水迷宮實(shí)驗由定位航行實(shí)驗和空間探索實(shí)驗組成，前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗，將大鼠從水迷宮的不同象限位置(遠(yuǎn)離隱藏平臺位置)、面朝黑色壁池放入水中，記錄大鼠爬上隱藏平臺的時間(逃避潛伏期)，取每日逃避潛伏期均值為最終結(jié)果；第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗，撤去水池中的隱藏平臺，以相同方法將大鼠放入水中，記錄大鼠1 min內(nèi)穿越平臺原位置的次數(shù)。

1.3.3樣本采集 行為學(xué)觀察結(jié)束后，禁食進(jìn)水12 h后，尾靜脈取血2 ml，靜置20 min，離心分離血清，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)錅y。麻醉、處死大鼠，分離海馬組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，制備組織病理切片(厚度為5 μm)，剩余組織置于液氮罐保存?zhèn)錅y。

1.3.4糖脂代謝指標(biāo)的檢測 經(jīng)全自動生化分析儀檢測大鼠血清空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、糖化血紅蛋白(hemoglobin Alc，HbA1c)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平。

1.3.5海馬組織病理損傷觀察 取海馬組織石蠟切片，行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠海馬組織病理損傷情況，并根據(jù)文獻(xiàn)[9]方法評分。

1.3.6實(shí)時熒光定量PCR檢測海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá) 取海馬組織約100 mg，參照RNA提取試劑盒提取總RNA，取等量合格樣品使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA鏈，再使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，上實(shí)時熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因的表達(dá)。

1.3.7蛋白免疫印跡法檢測海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá) 取海馬組織約100 mg加入RIPA組織細(xì)胞快速裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各組取等量蛋白進(jìn)行電泳(分離膠濃度為10%)，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，再取出PVDF膜置于含有5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入對應(yīng)蛋白一抗，4 ℃下孵育過夜，第2天洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠二抗，37 ℃下孵育1 h，再次洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影。應(yīng)用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，以p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β表示PI3K、AKT、GSK3β磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 布南色林對精神分裂癥大鼠行為學(xué)的影響與正常組比較，模型組刻板行為評分、曠場實(shí)驗總路程及逃避潛伏期升高，穿越平臺原位置次數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組刻板行為評分、曠場實(shí)驗總路程及逃避潛伏期降低，穿越平臺原位置次數(shù)升高(P<0.05)；但布南色林組與利培酮組行為學(xué)觀察數(shù)據(jù)的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 布南色林對精神分裂癥大鼠行為學(xué)的影響

2.2 布南色林對精神分裂癥大鼠糖脂代謝指標(biāo)水平的影響與正常組比較，模型組和布南色林組FPG、HbA1c、TG、TC、HDL及LDL水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但利培酮組FPG、HbA1c、TG及TC水平升高(P<0.05)，HDL和LDL水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 布南色林對精神分裂癥大鼠糖脂代謝指標(biāo)水平的影響

2.3 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織病理損傷的影響各組大鼠海馬組織切片HE染色見圖1。正常組大鼠海馬組織細(xì)胞排列緊密整齊，結(jié)構(gòu)層次清晰，胞體呈橢圓形或圓形；模型組海馬組織細(xì)胞排列稀疏，無明顯的結(jié)構(gòu)層次，胞核固縮嚴(yán)重；布南色林組和利培酮組仍存在胞核固縮現(xiàn)象，但細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)層次有改善。與正常組比較，模型組大鼠海馬組織病理損傷評分升高(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組大鼠海馬組織病理損傷評分降低(P<0.05)，但布南色林組與利培酮組海馬組織病理損傷評分的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織病理損傷評分的影響

圖1 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織病理損傷的影響HE染色×400A：正常組；B：模型組；C：利培酮組；D：布南色林組

2.4 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；但布南色林組和利培酮組PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組海馬組織PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平降低(P<0.05)；與模型組比較，布南色林組和利培酮組PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平升高(P<0.05)；但布南色林組和利培酮組PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 布南色林對精神分裂癥大鼠海馬組織PI3K/AKT/GSK3β通路蛋白表達(dá)的影響A：正常組；B：模型組；C：布南色林組；D：利培酮組；與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

精神分裂癥病因復(fù)雜，其臨床研究和治療存在一定局限性，其研究進(jìn)展緩慢，尤其是腦組織不同于其他外周組織易獲取活體樣本，多采用影像學(xué)和腦電生理學(xué)分析，但難以全面闡述其病因及發(fā)病機(jī)制，需構(gòu)建合理的動物模型進(jìn)行研究。MK-801是典型非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷劑，可廣泛參與中樞神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，引發(fā)幻覺、妄想、感覺遲鈍等精神分裂癥典型臨床癥狀，還會誘發(fā)刻板行為、共濟(jì)失調(diào)等行為學(xué)表現(xiàn)，與臨床精神分裂癥的疾病譜基本相符。本研究采用MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥大鼠模型，行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠刻板行為評分、曠場實(shí)驗總路程及逃避潛伏期升高，穿越平臺原位置次數(shù)降低，表明模型大鼠出現(xiàn)限制性和重復(fù)性的刻板行為，探索性活動減少，學(xué)習(xí)和記憶能力也下降，提示神經(jīng)分裂癥大鼠模型構(gòu)建成功。

布南色林作為非典型抗精神病藥物，對多巴胺D2、D3受體和5-羥色胺2A受體均有較高的親和力，D3受體可抑制多巴胺的釋放和流出，布南色林可拮抗D3受體，改善情緒、認(rèn)知等功能損傷。而且，布南色林對5-羥色胺2C、腎上腺素α1、組胺H1等受體的親和力較低，故發(fā)生體質(zhì)量增加、代謝異常、過度鎮(zhèn)靜等風(fēng)險也降低。本研究對精神分裂癥大鼠分別給予布南色林、利培酮灌胃處理后，大鼠認(rèn)知功能障礙及學(xué)習(xí)記憶能力提高，且兩種藥物改善能力相當(dāng)，這與臨床研究[10]結(jié)果相符。進(jìn)一步觀察給藥對模型大鼠體內(nèi)糖脂代謝的影響，結(jié)果顯示，相同給藥時間下，利培酮可提高FPG、HbA1c、TG及TC水平，但布南色林對糖脂代謝指標(biāo)無明顯的影響，與Mattingly et al[11]報道一致。同時，觀察大鼠海馬組織病理損傷，結(jié)果顯示，MK-801處理后海馬組織出現(xiàn)細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞核固縮等明顯病理損傷，布南色林組和利培酮組上述海馬組織損傷明顯減輕，表明布南色林和利培酮均可減輕MK-801誘導(dǎo)的海馬組織病理損傷。

關(guān)于精神分裂癥病因的假說很多，如多巴胺假說、神經(jīng)發(fā)育假說等，但該疾病的真正病因尚不清楚?？紤]精神分裂癥具有高遺傳性的特點(diǎn)，本研究從基因?qū)W角度出發(fā)，分析布南色林對精神分裂癥的改善機(jī)制。PI3K/AKT/GSK3β信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，且與軸突再生、神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定等密切相關(guān)[12]。PI3K是重要的肌醇和磷酸酰肌醇激酶，磷酸化產(chǎn)物可進(jìn)一步招募并活化AKT，激活的AKT可通過磷酸化GSK3β，降低GSK3β過度表達(dá)。馬征 等[13]研究顯示，利培酮可能通過調(diào)控PI3K/mTOR信號通路，治療癲癇所致精神障礙。Park et al[14]報道，奧氮平可激活初級海馬神經(jīng)元的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1(mTORC1)及其下游效應(yīng)及上游激活子(PI3K、MEK)的磷酸化，促進(jìn)樹突生長和突觸蛋白表達(dá)，從而影響神經(jīng)可塑性。推測同為非典型抗精神病藥物的布南色林可能對PI3K/AKT/GSK3β信號通路存在影響；本研究結(jié)果顯示，布南色林治療后，大鼠海馬組織PI3K、AKT和GSK3β磷酸化水平升高，表明布南色林可激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路，修復(fù)模型大鼠認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶減退。

綜上所述，布南色林可能通過激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路，修復(fù)精神分裂癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷，改善其認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力，但對大鼠糖脂代謝無明顯影響。