葉曉林，胥國(guó)麟，錢體軍，秦 鳳，王云濤，程煜航，趙文珍

EFHD2屬于EF-手域家族成員，是一個(gè)26.8 ku大小的高度保守的蛋白質(zhì),由一個(gè)低復(fù)雜性的帶有丙氨酸延伸的N-末端區(qū)域、一個(gè)功能性SH3結(jié)合基序、兩個(gè)功能性EF-手結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-末端螺旋結(jié)構(gòu)域組成。研究顯示其功能為一種調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白構(gòu)成細(xì)胞骨架，參與成核作用，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移[1-2]，還參與內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸[3-4]。目前EFHD2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤細(xì)胞遷移方面的研究較多，主要是涉及信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)。推測(cè)EFHD2能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的捆綁影響細(xì)胞骨架，參與的細(xì)胞內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸為Sertoli細(xì)胞的細(xì)胞連接的清除和形成提供協(xié)助。該研究主要探討EFHD2蛋白的缺失對(duì)Sertoli細(xì)胞連接蛋白成分的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器熒光顯微鏡(BX53,日本奧林巴斯公司)，Bio-Rad成像系統(tǒng)(Bio-Rad XR，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Stepone Plus, 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，伯樂垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源1645050、小型垂直電泳轉(zhuǎn)印槽,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司)。

1.2 主要試劑艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司：Anti-EFHD2抗體(ab106667)，Anti-Vimentin抗體(ab8978)，Anti-Occludin抗體(ab167161)，辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG二抗(ab6728)，Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG (ab150113)，Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(ab150116)。Biosharp蘭杰柯科技有限公司：PBS緩沖液(BL601A)、TBS緩沖液(BL602A)。翌圣生物科技(上海)股份有限公司：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(11202ES08)、Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(11139ES10)、碘化丙啶(40711ES10)。TRIzol試劑(15596026)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。RIPA組織裂解液(P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。Anti-β-actin抗體(#4970, 賽信通上海生物試劑有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞15只 SPF 級(jí)c57雄鼠，10周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于溫度 22～26 ℃、濕度 40%～60%環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。TM4細(xì)胞即正常小鼠Sertoli細(xì)胞，獲贈(zèng)于上海交通大學(xué)劉悅老師。

1.4 方法

1.4.1引物設(shè)計(jì) 運(yùn)用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR所需引物，引物序列見表1。EFHD2的siRNA由生工生物工程(上海)股份有限公司代設(shè)計(jì)，序列見表2，并且引物也一并由該公司合成。

表1 qRT-PCR涉及引物序列

表2 siRNA干擾序列

1.4.2qRT-PCR檢測(cè)EFHD2在各器官組織中mRNA水平的表達(dá) 分別取5只小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等組織，用手持均質(zhì)器研磨組織，采用TRIzol法提取各組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并對(duì)產(chǎn)物cDNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量擴(kuò)增，每種組織為EFHD2及內(nèi)參β-actin各重復(fù)3次。并對(duì)qPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用2-ΔΔCT法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.4.3Western blot 法檢測(cè)EFHD2在各組織中的蛋白表達(dá)水平 分別取5只小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢等組織，各取50 mg加入1 ml RIPA裂解液，用玻璃研磨器研磨組織，抽提蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h，孵育一抗(1 ∶1 000，4 ℃過夜)，TBST洗膜10 min/次，重復(fù)3次，孵育二抗(1 ∶20 000，室溫1 h)，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。使用Image J進(jìn)行灰度分析，對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.4免疫酶檢測(cè)EFHD2在睪丸組織的表達(dá) 取5只小鼠睪丸組織經(jīng)Bouin’s液固定、石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)、0.1% Triton X-100打孔、5%BSA封閉、一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶1 000)孵育1 h，DAB試劑顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察EFHD2在睪丸中的定位和分布情況，并且拍照。

1.4.5間接免疫熒光檢測(cè)EFHD2在睪丸組織中與Vimentin共定位情況 取新鮮睪丸組織進(jìn)行冰凍切片。丙酮固定15 min，0.5% Triton X-100打孔，5% BSA封閉，一部分切片一抗(1 ∶500)4 ℃過夜。二抗(1 ∶1 000)孵育2 h，PI染色熒光顯微鏡下觀察該蛋白在睪丸組織中的分布并且拍照。另一部分切片進(jìn)行Anti-EFHD2抗體和Anti-Vimentin抗體雙染色，鏡下觀察EFHD2和Vimentin共定位情況。

1.4.6脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法遞送siRNA進(jìn)入TM4細(xì)胞 TM4細(xì)胞接種于6孔板。設(shè)置5個(gè)組，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、3個(gè)干擾序列組。待細(xì)胞融合度到40%時(shí)，使用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染siRNA，siRNA終濃度為30 nmol/L。轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。48 h時(shí)使用RIPA裂解液提取蛋白。

1.4.7qRT-PCR檢測(cè)干擾后各組EFHD2相對(duì)表達(dá)量 提取各組細(xì)胞的總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著進(jìn)行qPCR。隨后，運(yùn)用2-ΔΔCT法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.4.8Western blot 檢測(cè)siRNA干擾TM4細(xì)胞48 h的EFHD2和Occludin的相對(duì)表達(dá)量 提取后的細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%BSA封閉2 h，孵育一抗(1 ∶1 000，4 ℃過夜)，TBST洗膜10 min/次，重復(fù)3次，孵育二抗(1 ∶20 000，室溫1 h)， ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光，Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照。用Image J進(jìn)行灰度分析，對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1EFHD2在各器官組織中相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示：EFHD2在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸等器官組織中均有不同程度的表達(dá)，肝和腦中表達(dá)量較其他組織高，在睪丸中最高(圖1A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)qPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果說明qPCR擴(kuò)增具有特異性(圖1B)。

圖1 小鼠各組織中EFHD2的相對(duì)表達(dá)量(A)與qPCR后電泳結(jié)果(B)a:心；b:肝；c:脾；d:肺；e:腎；f:腦；g:睪丸； EFHD2:100 bp；GAPDH:133 bp；與肝臟組織比較：***P<0.001

2.2 EFHD2蛋白在各器官組織中相對(duì)表達(dá)量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：EFHD2蛋白在小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸組織中均有表達(dá)，在肝臟、腦和睪丸組織中表達(dá)量較高(圖2)。

圖2 Western blot法檢測(cè)各器官組織中EFHD2蛋白的表達(dá)a:心；B:肝；C:脾；D:肺；E:腎；F:腦；G:睪丸；與肝組織比較：**P<0.01

2.3 免疫組化結(jié)果顯示EFHD2在Sertoli細(xì)胞中定位情況用免疫組化技術(shù)檢測(cè)EFHD2蛋白在睪丸組織中的分布情況，結(jié)果顯示：Sertoli細(xì)胞的胞質(zhì)周邊著色較深，而生精細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞著色較淺。這表明EFHD2蛋白主要分布于Sertoli細(xì)胞(圖3)。

圖3 免疫酶技術(shù)檢測(cè)EFHD2在小鼠睪丸中的定位情況A、B：EFHD2在小鼠睪丸中的定位；C：不加一抗的對(duì)照組；A、C：×200；B：×400

2.4 EFHD2在睪丸組織中與Vimentin共定位情況對(duì)小鼠睪丸組織進(jìn)一步進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果和免疫酶標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果一致，熒光在Sertoli細(xì)胞中著色較深，EFHD2蛋白主要分布于Sertoli細(xì)胞。此外，還采取了與Vimentin免疫熒光共定位檢測(cè)，結(jié)果顯示：EFHD2和Vimentin(Sertoli細(xì)胞特異性蛋白)在Sertoli細(xì)胞中熒光染色重疊，驗(yàn)證EFHD2確實(shí)是在Sertoli細(xì)胞表達(dá)的(圖4)。

圖4 間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果a:EFHD2在小鼠睪丸中的表達(dá)情況 ×400；B:EFHD2和Vimentin在小鼠睪丸中共定位情況 ×400

2.5 siRNA干擾TM4細(xì)胞24 h后EFHD2的相對(duì)表達(dá)量在進(jìn)行干擾后6 h，對(duì)攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的陰性對(duì)照序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率觀察(圖5)，可以觀察到已成功將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)TM4細(xì)胞。對(duì)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示(圖5B)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組EFHD2相對(duì)表達(dá)量相近，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mEFHD2-308與陰性對(duì)照組比較表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 siRNA轉(zhuǎn)染效率及各組EFHD2相對(duì)表達(dá)量 ×100a:空白對(duì)照組；B:陰性對(duì)照組；C:mEFHD2-731組；D: mEFHD2-474組；E:mEFHD2-308組；與陰性對(duì)照組比較：*P<0.05

2.6 siRNA干擾TM4細(xì)胞48 h后EFHD2和Occludin的相對(duì)表達(dá)量Western blot結(jié)果顯示(圖6)，mEFHD2-308的EFHD2蛋白表達(dá)量較其他組下將較明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。進(jìn)一步檢測(cè)緊密連接蛋白成分Occludin的相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣是mEFHD2-308的下降較其他組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。

圖6 Western blot法檢測(cè)siRNA干擾48 h后各組EFHD2和Occludin的表達(dá)a:陰性對(duì)照組；B: mEFHD2-731組；C: mEFHD2-474組；D: mEFHD2-308組；E:空白對(duì)照組；與陰性對(duì)照組比較：****P<0.000 1

3 討論

Sertoli細(xì)胞與生精細(xì)胞有著各種細(xì)胞連接，通過各種細(xì)胞連接來調(diào)節(jié)生精細(xì)胞的各種狀態(tài)Sertoli細(xì)胞底部和基膜相連，構(gòu)成血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)的一部分。BTB的完整為精子發(fā)生提供一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境，血睪屏障的不完整將會(huì)影響精子的發(fā)生[5]。細(xì)胞連接中的緊密連接、錨定連接和橋粒連接是 BTB 的主要組成成分[6]。并且，細(xì)胞連接周期性的清除和形成是生精細(xì)胞向生精小管管腔運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)[7]。細(xì)胞連接的清除可以讓生精細(xì)胞分裂和向管腔運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞連接形成后，生精細(xì)胞接收Sertoli細(xì)胞提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)合成，為下個(gè)細(xì)胞周期做準(zhǔn)備。Sertoli細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是正常生精的基礎(chǔ)。Sertoli細(xì)胞的細(xì)胞連接調(diào)控涉及多個(gè)方面。其中細(xì)胞骨架成分，如微絲、微管、中間絲及其相關(guān)的波形蛋白(Vimentin)等多種蛋白，可通過支持、黏附、信號(hào)傳導(dǎo)等方式促進(jìn)和維持SC的連接結(jié)構(gòu)[8-9]。細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)的清除和形成依賴支持細(xì)胞的內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸，Sertoli細(xì)胞連接的清除和形成還依賴于細(xì)胞內(nèi)吞作用和囊泡運(yùn)輸過程，如通過細(xì)胞內(nèi)吞作用清除細(xì)胞連接處的連接蛋白可破壞細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)；而連接蛋白隨著囊泡運(yùn)輸重新與細(xì)胞膜融合可在該處形成新的細(xì)胞連接。而內(nèi)吞和囊泡運(yùn)輸需要細(xì)胞骨架蛋白的參與[10-11]。

緊密連接是構(gòu)成血睪屏障的主要結(jié)構(gòu)之一，而緊密連接有好幾種蛋白構(gòu)成，有Occludin、ZO-1、Claudin等成分[12]。研究[13]顯示，敲除Occludin的小鼠出現(xiàn)了不同程度的生精障礙。

結(jié)合Sertoli細(xì)胞連接需要周期性的清除和形成，來維持正常的生精過程。推測(cè)EFHD2參與Sertoli細(xì)胞連接的周期性清除和生成。EFHD2對(duì)Sertoli細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白和骨架蛋白的調(diào)節(jié)，影響了Sertoli細(xì)胞的細(xì)胞連接的周期性開放，從而影響生精細(xì)胞的發(fā)育。EFHD2的正常存在對(duì)正常生精環(huán)境的維持起到了不可或缺的作用。因此本研究觀察EFHD2在睪丸中的表達(dá)和定位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了推測(cè)，EFHD2蛋白在睪丸中表達(dá)水平較一般組織要高，且定位在支持細(xì)胞(與Sertoli細(xì)胞特異性蛋白Vimentin定位一致)。接著成功地進(jìn)行了TM4細(xì)胞的siRNA干擾，檢測(cè)Occludin蛋白和EFHD2蛋白一樣呈下降趨勢(shì)，驗(yàn)證了在細(xì)胞層面，EFHD2和Occludin的合成是有關(guān)聯(lián)的。Occludin作為BTB和緊密連接的蛋白成分，BTB和緊密連接對(duì)精子的發(fā)生又十分的重要，那么Occludin在Sertoli細(xì)胞的表達(dá)減少將會(huì)影響精子的發(fā)生。本研究明確了EFHD2在小鼠睪丸中的定位及對(duì)細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin形成的影響，闡明了EFHD2蛋白維持Sertoli細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)起到了重要作用，為繼續(xù)研究EFHD2在睪丸中的作用奠定了基礎(chǔ)。