何尚峰，盧香云，馬琰迪，孫 琦，高海霞，張洪攀，阿米爾，俞雪燕，禹 潔，王文潔，陳云昭，李 鋒,，崔曉賓,

食管癌(esophageal carcinoma，EC)在全球所有癌癥中發(fā)病率居第七位，病死率居第六位[1]，有兩種主要的組織學(xué)亞型(鱗狀細胞癌和腺癌)，其中食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國EC中的主要亞型，臨床表現(xiàn)為侵襲性且預(yù)后不良[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是介導(dǎo)真核生物蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵組分[3]，主要由3種蛋白質(zhì)組成：泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)，3種酶的共同協(xié)作，完成對底物蛋白的識別及泛素化降解[4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)作為E3泛素連接酶中RING家族的一員，參與降解多種已知的原癌蛋白，包括c-MYC、Cyclin E、NOTCH、MCL1、mTOR、c-JUN、AURKA，在多種癌癥中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮著重要作用[5]，而FBXW7在ESCC中的作用有待進一步研究。該研究旨在探究FBXW7在ESCC中的表達與生存預(yù)后的關(guān)系，以及FBXW7對ESCC細胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本實驗選取2000—2016 年間ESCC石蠟包埋組織樣本共224例。其中癌組織171例，距離ESCC組織3 cm以上部位的癌旁組織53例，患者術(shù)前均未接受過放療或化療。由兩名資深病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類對 HE 切片進行復(fù)片，并參照2017年UICC/AJCC 第8版食管癌TNM分期標準進行分期。所收集的病例均得到患者的同意并簽署知情同意書。并收集患者的個人資料、腫瘤分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及 TNM 分期等臨床病理資料，通過電話等對患者進行隨訪，截至2020年8月或死亡日期。

1.1.2細胞株 本實驗所用食管鱗癌細胞系Eca109和Eca9706均購買自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.3試劑 FBXW7抗體(貨號：ab109617)購自英國Abcam公司；胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)、PBS緩沖液購自以色列BI公司；青鏈霉素混合液(貨號：P1400)、4%組織細胞固定液(貨號：P1110)、0.1%結(jié)晶紫染色液(貨號：G1063)、5×蛋白上樣緩沖液(貨號：P1040)、1×TBST緩沖液(貨號：T1085)購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FBXW7質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建；CCK-8 試劑盒(貨號：MI00615)、ECL發(fā)光液(貨號MI00607C)購自米鼠(西安)生物科技有限公司；基質(zhì)膠購自美國Corning公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒(貨號：PG112)、無蛋白快速封閉液(貨號：PS108P)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ENO1抗體(貨號：sc-100812)購自美國Santa公司；GAPDH抗體(貨號：AF0006)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根酶標記鼠二抗(貨號：ZB-2305)、辣根酶標記兔二抗(貨號：ZB-2301)：購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱、超凈臺工作臺、-80 ℃冰箱(美國賽默飛世爾科技有限公司)；酶標儀(美國ABI公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；4 ℃冰箱(中國海爾集團公司)；ECL Western成像儀(北京百晶生物技術(shù)公司)；電泳儀、濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-RAD 公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色及評估 使用 EnVision 兩步法進行免疫組化實驗，使用FBXW7抗體，調(diào)整抗體稀釋比例為1 ∶8 000。染色結(jié)果評分均由兩位高年資的病理醫(yī)師獨立雙盲法評定。FBXW7主要定位于細胞核中，以呈棕黃色顆粒為陽性。計分方法如下：①按細胞著色強度計分，無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；②按腫瘤陽性細胞的百分比計分，<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；③將著色強度及陽性百分比兩項評分結(jié)果的得分相乘，最終得分≤3分為低表達，>3分為高表達。若對結(jié)果存在分歧則請第三位高年資的病理醫(yī)師評定。

1.2.2細胞培養(yǎng) 將Eca109和Eca9706細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到80%進行換液及傳代處理，進行后續(xù)實驗。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)，每孔計數(shù)50萬個細胞，培養(yǎng)過夜6～8 h后，每個EP管中加入100 μl RPMI-1640培養(yǎng)基，再分別加入7.5 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑和2.5 μg FBXW7質(zhì)粒，將兩管混勻后靜置5～10 min，棄去6孔板中原有培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，將混合液體均勻滴入每個孔中，4～6 h后進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h以供后續(xù)實驗使用。

1.2.4平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細胞，消化離心后計數(shù)。以每孔1 000個細胞接種于6孔板中，每孔加入2 ml的培養(yǎng)液，鋪勻細胞后放入培養(yǎng)箱中，每隔3～4 d換液，培養(yǎng)10 d左右，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，使用PBS清洗2～3次，加入4%組織細胞固定液于4 ℃固定20 min，PBS清洗去除多余的組織細胞固定液，0.1%結(jié)晶紫染色液4 ℃染色，20 min后PBS再清洗2次。將培養(yǎng)板置于室溫晾干，在倒置顯微鏡下進行觀察，計數(shù)每組細胞克隆形成數(shù)。

1.2.5CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細胞，消化離心后計數(shù)，在96孔板中每孔接種Eca9706細胞2 000個，Eca109細胞每孔接種1 000個，每組設(shè)置5個復(fù)孔，并在調(diào)零孔加入培養(yǎng)基，分別在0、24、48、72、96 h于避光條件下每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值，重復(fù)檢測3次，取均值。

1.2.6細胞劃痕實驗 將細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的各組細胞培養(yǎng)24 h后，待細胞密度達到90%左右，用1 ml滅菌槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌兩次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、48 h拍照。

1.2.7Transwell細胞遷移實驗 消化轉(zhuǎn)染24 h后的細胞，加入1 ml 1×PBS和RPMI-1640洗滌，用RPMI-1640重懸并計數(shù)，細胞密度調(diào)整為3×104個/ml，向上室加入200 μl細胞懸液，下室加入600 μl含20% 胎牛血清的培養(yǎng)基。避免上下室之間氣泡產(chǎn)生，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出。吸棄上、下室培養(yǎng)液，l×PBS清洗2遍，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)細胞。下室加入1 ml的4%組織細胞固定液4 ℃固定20 min，用棉簽擦拭上室內(nèi)部。棄去下室液體，并加入0.1%結(jié)晶紫染色液，4 ℃染色20 min，用PBS洗去結(jié)晶紫染色液，用棉棒在上室中輕輕轉(zhuǎn)動，吸干上室水分。倒置顯微鏡上放置載玻片，將小室放在上面進行拍照。

1.2.8Transwell細胞侵襲實驗 侵襲實驗前需提前準備基質(zhì)膠，將-80 ℃分裝保存的基質(zhì)膠，于實驗前12 h、4 ℃融化，用無血清培養(yǎng)液RPMI-1640按照1 ∶8的比例稀釋，每孔加入45 μl(在冰上進行)，37 ℃孵育箱2 h使其凝固，吸棄多余液體，后續(xù)步驟同于遷移實驗。

1.2.9Western blot實驗 實驗前根據(jù)PAGE凝膠快速制備試劑盒說明書制備PAGE凝膠，將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞用PBS清洗2～3次，蛋白提取全程在冰上進行，加入5×蛋白上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min，電泳后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，無蛋白快速封閉液封閉1 h，加入一抗孵育盒4 ℃過夜(FBXW7稀釋比例1 ∶1 000；ENO1稀釋比例1 ∶1 000；GAPDH稀釋比例1 ∶1 000)，1× TBST緩沖液清洗5 min×6次，加入二抗孵育盒室溫孵育2 h(辣根酶標記鼠二抗稀釋比例1 ∶8 000；辣根酶標記兔二抗稀釋比例為1 ∶10 000)，1×TBST清洗5 min×6次，使用ECL發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中蛋白表達水平FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均出現(xiàn)核膜的染色，但在核仁中的染色有顯著差異，在ESCC組織中的蛋白表達水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。見圖1和表1。

表1 FBXW7在癌旁組織和ESCC組織中的蛋白表達水平(n)

圖1 癌旁組織與ESCC組織中FBXW7蛋白表達情況 A、B：癌旁組織免疫組織化學(xué)染色情況 ×40、×200；C、D：ESCC組織免疫組織化學(xué)染色情況 ×40、×200

2.2 FBXW7表達與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)前期隨訪數(shù)據(jù)，將有臨床病理相關(guān)資料的73例ESCC患者根據(jù)免疫組化評分(immunohistochemical score，IS)進行分組，IS≤3分為低表達，IS>3分為高表達，表2統(tǒng)計結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達的腫瘤分化程度更低(P=0.011)，F(xiàn)BXW7高表達的ESCC患者TNM分期更早(P=0.032)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而與患者的性別、年齡、部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等臨床病理資料的關(guān)系差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 FBXW7的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 FBXW7與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系在224例ESCC患者中，有63例患者通過電話隨訪、醫(yī)院記錄等方式獲得完整的隨訪信息，截止日期為2020年8月或死亡日期。通過Kaplan-Meier生存分析ESCC患者FBXW7蛋白表達水平與生存期及存活情況的關(guān)系，生存曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7低表達組的生存時間短于FBXW7高表達患者，F(xiàn)BXW7低表達組的預(yù)后顯著差于FBXW7高表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030)。見圖2。

圖2 FBXW7的表達與ESCC患者預(yù)后的生存分析曲線

2.4 FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染最佳比例Eca9706細胞系中，分別使用不同F(xiàn)BXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000比例在6孔板中進行轉(zhuǎn)染，F(xiàn)BXW7質(zhì)粒加入2.5 μg，Lipofectamine2000分別加入0、5、7.5、10 μl，分為1 ∶0、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4的濃度梯度，轉(zhuǎn)染48 h后通過Western blot檢測FBXW7蛋白表達水平，結(jié)果顯示FBXW7質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000的比例為1 ∶2 或者1 ∶3時，過表達效果較好，Eca109細胞系中使用相同比例進行后續(xù)實驗。見圖3。

圖3 Western blot檢測Eca9706細胞系中不同比例轉(zhuǎn)染FBXW7質(zhì)粒后蛋白表達水平a：1 ∶0組；b：1 ∶2組；c：1 ∶3組；d：1 ∶4組

2.5 過表達FBXW7對ESCC細胞增殖能力的影響CCK-8實驗檢測顯示，接種細胞后第3天開始,在Eca9706和Eca109細胞中，過表達FBXW7組的吸光度值開始低于對照組，到達第5天時，Eca9706細胞系中，過表達FBXW7組吸光度值低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=172.100,P<0.001)，Eca109細胞系中，過表達FBXW7組吸光度值也低于對照組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=241.101,P<0.001)(圖4)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，Eca9706細胞中，過表達FBXW7組細胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.078，P<0.001)；Eca109細胞中，過表達FBXW7組細胞集落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.160，P<0.001)，上述結(jié)果提示FBXW7 可以抑制ESCC細胞的增殖能力。見圖5。

圖4 CCK-8實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的增殖能力a:Eca9706細胞；B:Eca109細胞；與對照組比較：***P<0.001

圖5 平板克隆形成實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的增殖能力與對照組比較：***P<0.001

2.6 過表達FBXW7對ESCC細胞遷移、侵襲能力的影響細胞劃痕實驗顯示劃痕結(jié)束48 h后，Eca9706細胞系中，過表達FBXW7組的細胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.822，P<0.001)。Eca109細胞系中，過表達FBXW7組的細胞遷移率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.015，P<0.001)(圖6)。Transwell細胞遷移、侵襲實驗分別于鋪完小室24、48 h后進行固定染色和拍照，結(jié)果顯示，在Eca9706細胞中，過表達FBXW7組的細胞遷移數(shù)目低于對照組的細胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.326，P<0.001)，過表達FBXW7組的細胞侵襲數(shù)目低于對照組的細胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.959，P<0.001)。在Eca109細胞中，過表達FBXW7組的細胞遷移數(shù)目低于對照組的細胞遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.034，P<0.001)，過表達FBXW7組的細胞侵襲數(shù)目低于對照組的細胞侵襲數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.579，P<0.001)(圖7)。以上結(jié)果均表明FBXW7可以抑制ESCC細胞Eca9706和Eca109的遷移、侵襲。

圖6 細胞劃痕實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的遷移能力A：Eca9706細胞中過表達FBXW7組與對照組劃痕實驗情況；B：Eca109細胞中過表達FBXW組與對照組劃痕實驗情況；與對照組比較：***P<0.001

圖7 Transwell細胞遷移、侵襲實驗檢測Eca9706和Eca109細胞的遷移、侵襲能力A：Eca9706細胞中過表達FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；B：Eca109細胞中過表達FBXW7組與對照組遷移侵襲情況；與對照組比較：***P<0.001

3 討論

FBXW7作為E3泛素連接酶中的一員，通過促進多種癌蛋白的降解來發(fā)揮其腫瘤抑制作用[6]。其功能的發(fā)揮需要依賴SCF(SKP1/CUL1/F-box)復(fù)合體的形成，它包含一個CULLIN家族支架蛋白，該蛋白與具有催化活性的RING finger(RBX1)結(jié)合，RBX1可以招募E2泛素結(jié)合酶(UBC)和SKP1，后者與F-box相互作用，F(xiàn)-box蛋白作為底物識別亞單位發(fā)揮作用[7]。目前，F(xiàn)BXW7在ESCC中的表達及其對ESCC細胞生物學(xué)行為影響的相關(guān)研究尚不多見，有報導(dǎo)提出miR-25可以通過抑制FBXW7靶向NOTCH1，進而促進ESCC細胞的侵襲和遷移[8-9]，另外，miR-223也可以負向調(diào)控FBXW7，其高表達及FBXW7低表達與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[10]，部分文獻也報導(dǎo)FBXW7的低表達與患者不良預(yù)后呈正相關(guān)[11]，且與化療敏感性相關(guān)[12]。

本研究首先檢測了ESCC石蠟組織樣本與癌旁石蠟組織樣本中FBXW7的表達情況，結(jié)果顯示FBXW7在ESCC組織及癌旁組織中均有核膜的表達，ESCC組織中核仁的表達低于癌旁組織，文獻[5-6]提出FBXW7在多種腫瘤中作為抑癌基因降解癌蛋白，該作用大多是在核內(nèi)發(fā)生，這與本研究FBXW7在核仁中差異定位的結(jié)果相一致，而核膜中普遍的著色提示FBXW7在核膜的定位可能與其抑癌功能無關(guān)。結(jié)合ESCC患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)相較于低分化患者，在中到高分化患者中FBXW7的表達明顯更高，此外，F(xiàn)BXW7表達水平還與ESCC患者TNM分期相關(guān)，并且在Ⅰ+Ⅱ期中表達更高。腫瘤的分化程度和病理學(xué)分期是目前用來評估腫瘤生物學(xué)行為和診斷的重要的指標，主要用于惡性腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的評估，對ESCC患者的生存分析也表明，F(xiàn)BXW7高表達組患者的生存預(yù)后明顯優(yōu)于FBXW7低表達組，以上研究結(jié)果提示FBXW7在ESCC中可能發(fā)揮抑癌作用。為了進一步探究FBXW7對ESCC細胞生物學(xué)行為的影響，使用過表達的FBXW7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩株ESCC細胞系(Eca109和Eca9706)，CCK-8實驗以及平板克隆形成實驗結(jié)果提示，過表達FBXW7組的Eca109和Eca9706細胞增殖能力發(fā)生了顯著的下降，同時細胞劃痕實驗，Transwell細胞遷移、侵襲實驗結(jié)果也提示，過表達FBXW7組中，兩株ESCC細胞的遷移能力及侵襲能力也均出現(xiàn)明顯減弱。

綜上所述，F(xiàn)BXW7可能通過抑制ESCC細胞的增殖、侵襲、遷移的能力，進而影響ESCC的發(fā)展。結(jié)合既往文獻報導(dǎo)，推測FBXW7在ESCC中同樣是通過靶向降解某種癌蛋白，發(fā)揮其抑癌作用。