錢仁哲，周大臣，陸子恒，賀 良，潘樹波，張 彬

原發(fā)性肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤病死率的第二位，而其中以肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)最為常見[1]。目前，手術切除是HCC最有效的治療手段，射頻消融、動脈栓塞化療、放療及索拉非尼等靶向藥物治療也均可改善患者預后[2]，但是HCC患者的預后仍難以令人滿意。因此，尋找有效的起到預后監(jiān)測作用的分子標志物有著重要意義。

真核細胞翻譯起始復合物4F(eukaryotic cell translation initiation complex 4F，EIF4F)調控基因包含了4EBP1、EIF4E、EIF4G等[3-4]。細胞生長過程依賴于一個復雜的大分子合成協(xié)調程序，該程序可以適應環(huán)境的約束。在真核生物中，哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路是這一過程的主要調控因子，部分通過控制EIF4F起始復合物來調節(jié)真核細胞mRNA的翻譯。本課題組前期研究顯示，在HCC細胞系中突變4EBP1的T37/46磷酸化位點，HCC細胞的增殖被顯著抑制，并推測其可能與HCC患者的臨床預后相關。該研究評估EIF4F復合物與HCC患者預后臨床之間的相關性，以期預測HCC患者預后生存期。

1 材料與方法

1.1 主要材料胎牛血清購自美國Gibco公司；一抗4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E,Phop(Ser209)-EIF4E、EIF4G購自美國CST公司；山羊抗兔或抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1臨床數(shù)據的收集與分析 從標本庫中篩選出符合納入條件的HCC患者組織，篩選時間為2000—2014年，制作組織芯片(tissue microarray,TMA)。其納入標準為：①病理明確診斷的HCC患者；②首次行手術治療的患者。排除標準為：①腫瘤復發(fā)患者；②術前有使用化療及靶向藥物的患者；③同時發(fā)生了其他部位癌變的腫瘤患者；④臨床病理資料不完整的腫瘤患者。TMA組織芯片記錄了患者入院以來的肝功能指標、術后病理報道的腫瘤的大小及衛(wèi)星灶、出院之后的3年生存率和5年生存率及生存狀態(tài)等。該研究已通過安徽醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審查(編號：20200863)。

1.2.2蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、二甲苯Ⅲ 10 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min、50%乙醇5 min梯度脫蠟。將石蠟切片放入蘇木精染液0.5～1 min，自來水漂洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水漂洗，然后1%氨水水溶液返藍1 min，流動水沖洗數(shù)秒,放入伊紅染液中染色數(shù)秒，流動水漂洗。石蠟切片依次放入75%乙醇2 min，85%乙醇2 min，無水乙醇Ⅰ 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯5 min透明，將切片從二甲苯中取出，中性樹脂封片。

1.2.3免疫組織化學染色(immunohistochemistry，IHC) 將組織芯片在60 ℃烘箱中烤片、脫蠟，然后依次將烤好的切片放入二甲苯Ⅰ 6 min，二甲苯Ⅱ 6 min，二甲苯與無水乙醇3 min，無水乙醇6 min，90%乙醇3 min，70%乙醇3 min，50%乙醇3 min，純水10 min梯度脫蠟；將芯片放入裝有枸櫞酸鈉緩沖液的染色槽內，放入高壓鍋內，裝水，蓋上蓋子，待上汽上到最大時開始計時20 min,關火放氣，取出染色槽，流動水沖洗10 min；將組織芯片浸入30%過氧化氫與甲醇1 ∶9體積混合的混合液中10 min，以過氧化氫酶封閉，用PBS沖洗15 min；破膜液破膜10 min，PBS沖洗15 min；用1%牛血清白蛋白封閉2 h；組織芯片與第一抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過夜；室溫下依次加入反應增強液20 min、辣根酶標記抗兔IgG聚合物30 min，以DAB為顯色劑，蘇木精復染5 s，最后將切片放入50%乙醇3 min、70%乙醇3 min、90%乙醇3 min、無水乙醇6 min、二甲苯與無水乙醇3 min、二甲苯Ⅰ 6 min、二甲苯Ⅱ 6 min脫水，中性樹脂封片。使用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4隨訪 通過與患者或者患者親屬的聯(lián)系來保持對術后出院患者病情的追蹤，可以有效記錄術后患者的恢復情況及生存狀況。對本標本庫中共743位iHCC患者的臨床數(shù)據進行隨訪，具有隨訪信息的為94位。對于術后出院患者最長的隨訪時間為14年，中位隨訪時間為48個月。

1.3 統(tǒng)計學處理使用SPSS 25軟件對患者的臨床特征與目標基因的表達水平進行非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis，K-W)分析。使用R4.0.5軟件對臨床數(shù)據和吸光度值進行統(tǒng)計分析，組織芯片中各目標基因的表達水平的相關性通過程序包PerformanceAnalytics進行分析。繪制KM(Kaplan-Meier)生存曲線，并通過Cox回歸分析計算各影響因素的HR值。通過Nomogram評估各影響因素與HCC患者預后的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 納入患者的臨床特征在94例HCC患者的肝癌臨床信息中，將Phop(T37/46)-4EBP1與患者的臨床特征進行統(tǒng)計分析，方差齊性檢驗提示數(shù)據不符合正態(tài)分布，因此行非參數(shù)檢驗。因2012年之前未行病理學微血管侵犯檢測，因此相關數(shù)據未納入本研究統(tǒng)計分析。見表1。

表1 4EBP1(T37/46)的激活狀態(tài)與HCC患者臨床特征關系分析

2.2 EIF4F復合物的調控基因免疫組化染色及其吸光度值在94例HCC患者的免疫組化染色結果中，EIF4F復合物的調控基因在腫瘤組織中的表達高于其在癌旁組織中的表達(P<0.05)；4EBP1、Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、Phop(Ser209)-EIF4 E、EIF4G的柱狀圖提示腫瘤組織中的吸光度值高于其癌旁組織中的(P<0.001或P<0.000 1)。見圖1。

圖1 肝癌組織及癌旁組織中EIF4F復合物調控基因的表達及吸光度值分析 IHC ×400T：肝癌組織；N：癌旁組織；與癌旁組織比較：***P<0.001，****P<0.000 1

2.3 EIF4F復合物調控基因的蛋白表達量之間的相關性分析在94例HCC患者的肝癌組織中，對EIF4E、EIF4G、Phop(T37/46)-4EBP1的蛋白表達量進行表達的相關性分析，EIF4E與EIF4G的表達量顯著相關，相關系數(shù)為0.51；Phop(T37/46)-4EBP1與EIF4E、EIF4G的相關系數(shù)分別為0.22、0.13。見圖2。

圖2 EIF4F復合物調控基因的蛋白表達量之間的相關性分析

2.4 Phop(T37/46)-4EBP1與患者生存率的相關性在94例HCC患者的肝癌組織中，Phop(T37/46)-4EBP1表達的生存曲線，Phop(T37/46)-4EBP1高表達組較非高表達組的患者預后生存時間短，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.038)。見圖3。

圖3 HCC患者的生存曲線分析

2.5 Phop(T37/46)-4EBP1的表達與HCC患者臨床特征的關系將94例HCC患者的指標納入多因素回歸分析，分析Phop(T37/46)-4EBP1、EIF4E、EIF4G是否過表達，腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤的分化程度、患者的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平高低對患者預后生存期的影響，在此基礎上做出Cox風險比例模型，在以上各種因素與HCC患者預后生存期之間的關系中，腫瘤數(shù)目與患者預后之間的相關性最顯著(P=0.035)。見圖4。

圖4 HCC患者的多因素回歸分析

2.6 列陣圖模型預測HCC患者預后生存時間情況以Cox風險比例模型為基礎，對各個危險因素的風險比例分別給予評分，以各患者最終得分總和來預測3年生存率和5年生存率，可以看到Phop(T37/46)-4EBP1與EIF4E的評分是相對較高的，提示其對于HCC患者預后生存時間有著更大的意義。見圖5。

圖5 HCC納入患者臨床數(shù)據回歸分析的列陣圖模型

3 討論

4EBP1的磷酸化狀態(tài)與HCC患者的術后總體生存時間負相關，HCC組織中的4EBP1磷酸化水平增高，與患者預后生存時間顯著負相關(圖3)。EIF4E與EIF4G的表達是線性相關的；Phop(T37/46)-4EBP1與患者預后3年存活率、5年存活率、腫瘤直徑大小、AFP值呈線性相關，可以作為臨床重要的評估或參考指標。

Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的分子功能失活形式。4EBP1是mTOR信號通路的下游中介，mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[5]，通過磷酸化4EBP1和S6K促進細胞生長和增殖，從而控制蛋白質的翻譯過程。在相關性分析中可以看到，EIF4F復合物中的EIF4E和EIF4G之間是線性增加的，而Phop(T37/46)-4EBP1與其之間并沒有直接的相關性；單獨將Phop(T37/46)-4EBP1與患者預后3年存活率、5年存活率、腫瘤直徑大小、AFP等值做Cox風險比例模型回歸分析時，得出他們之間具有正相關的關系；列陣圖模型分析，由患者年齡、3年生存率、5年生存率、腫瘤直徑大小、AFP、EIF4F復合物等值共同評分，預測預后，Phop(T37/46)-4EBP1和EIF4E對于患者預后的評分所占權重較高，提示其對于HCC患者預后生存時間的影響可能較大。

有證據表明，mTOR下游4EBP1、EIF4E水平上的蛋白合成被破壞可以促進腫瘤的形成[6-7]，Phop(T37/46)-4EBP1引導增殖致癌信號，是一個高度相關的惡性潛能分子標記[8]。生長因子受體和細胞信號通路在人類癌癥的發(fā)生中起著重要的作用，膜生長因子受體的激活通過至少兩種主要的生物化學途徑，PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK途徑驅動細胞增殖信號[9]。PI3K-AKT通路通過激活mTOR激酶并隨后磷酸化其底物4EBP1和S6K來調控翻譯。MAPK通路，參與細胞增殖、存活、凋亡和代謝，也有助于4EBP1的磷酸化[10-11]。PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK通路都介導了4EBP1的磷酸化，導致了Cap依賴的mRNA翻譯起始復合物的形成Phop(T37/46)-4EBP1抑制4EBP1的活性并伴隨Cap依賴翻譯的激活，可促進細胞增殖，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[12-13]。Phop(T37/46)-4EBP1是4EBP1的滅活形式，作為腫瘤啟動子，將上游的致癌信號匯聚并驅動下游的增殖信號，啟動細胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)、C-MYC或血管內皮生長因子(VEGF)等致癌蛋白的合成。Phop(T37/46)-4EBP1在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌中已被證實與預后密切相關[14]，也有報道[15]指出Phop(T37/46)-4EBP1與許多惡性腫瘤(包括腎細胞癌、黑色素瘤、星形細胞瘤、食道鱗狀細胞癌)的侵襲性病理分級與患者的不良預后相關，這對于惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展至關重要，Phop(T37/46)-4EBP1在這些腫瘤中的表達都提示了Phop(T37/46)-4EBP1在腫瘤的預后中起到了至關重要的作用。

該研究也有一定的局限性。標本庫中的患者失訪率較高，最終納入分析的HCC患者臨床數(shù)據存在部分缺失。部分指標的數(shù)據非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。對于EIF4F在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的分子生物學機制，本課題組仍在進一步研究。