金芊芊，馬許可，朱雪瑞，查正寶，錢海生

惡性腫瘤極大地危害著人們的生命健康[1-3]。傳統(tǒng)的癌癥治療方法如外科手術(shù)、放療等，均存在一定副作用，無法取得令人滿意的治療效果[4-6]。近年來，光熱療法(photothermal therapy，PTT)因其高特異性、微創(chuàng)性等優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注。在近紅外(near-infrared，NIR)光作用下，PTT主要利用光熱劑將吸收的光能轉(zhuǎn)換成熱量，使治療區(qū)域溫度升高，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的消融[7-8]。PTT也存在一定的局限性，有必要聯(lián)合多種方法實(shí)現(xiàn)腫瘤的有效治療。該研究通過溶劑熱法成功合成了ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)，基于其優(yōu)異的光熱性能和獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步負(fù)載阿霉素(doxorubicinol，DOX)得到了ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)，基于光熱-化學(xué)療法聯(lián)合研究其抗腫瘤功效，為探究腫瘤的新型治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器紫外-可見分光光度計(jì)(U-5100，日立高新技術(shù)公司)；熒光光譜儀(FLS980，英國Edinburgh公司)；X射線光電子能譜儀(ESCALAB250Xi，美國Thermo Scientific公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100F)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SU8020)(日本日立公司)；酶標(biāo)儀(ELx800，美國伯騰儀器有限公司)；紅外熱成像儀(Testo 869，瑞徽電子上海有限公司)。四水合乙酸鎳(C4H6NiO·4H2O)、乙二醇(C2H6O2)均購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿霉素(C27H29NO11)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的合成根據(jù)已報(bào)道的方法制備了ZnS納米球[7-8]，將其作為模板，通過溶劑熱方法合成了ZnxNi1-xS空心納米球。在20 ml乙二醇中加入ZnS(40 mg)，超聲10 min得到分散均勻的溶液，隨后加入5 ml乙酸鎳(0.64 mmol)的乙二醇分散液，室溫?cái)嚢?0 min后，于高壓反應(yīng)釜中140 ℃反應(yīng)4 h。等待反應(yīng)結(jié)束之后，關(guān)閉烘箱，使其自然降溫，離心收集產(chǎn)物。

1.3 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的光熱性能研究配制不同濃度的ZnxNi1-xS水溶液(0、30、60、90、120、150 μg/ml)，在NIR光照射下(808 nm, 2.0 W/cm2，10 min)，使用紅外熱成像儀(Testo 869)每隔10 s記錄溶液溫度變化并采集對(duì)應(yīng)的紅外熱成像圖片。為了進(jìn)一步評(píng)估激光功率對(duì)光熱性能的影響，使用不同功率NIR光(1.0、1.5、2.0 W/cm2)照射ZnxNi1-xS(150 μg/ml)水溶液并記錄實(shí)時(shí)溫度變化。

1.4 ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)的合成避光條件下，將已合成的ZnxNi1-xS空心納米球(5 mg)分散在10 ml DOX溶液中(5 mg)，攪拌24 h后，用去離子水洗去未反應(yīng)的DOX，離心至上清液無色，冷凍干燥后可得ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)。

1.5 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線測定使用10 ml容量瓶配置一系列濃度的DOX水溶液(1、2、3、4、5、6 μg/ml)，通過熒光光譜儀測定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長476 nm, 發(fā)射波長范圍510～600 nm)，通過線性擬合可得到DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 ZnxNi1-xS@DOX藥物釋放研究將1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)裝載于截留分子量為8 000～14 000的透析袋中，隨后將其置于裝有30 ml不同pH的PBS(pH=5.0、6.5、7.4)緩沖液中，于恒溫?fù)u床中震蕩并在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)取樣，通過熒光光譜儀測量介質(zhì)溶液熒光強(qiáng)度，從而確定其濃度。此外，還通過改變恒溫?fù)u床溫度(37、45 ℃)探究溫度對(duì)藥物釋放的影響。為了研究光響應(yīng)的DOX釋放行為，將1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)溶液置于黑暗條件下作為對(duì)照組，同時(shí)對(duì)另一實(shí)驗(yàn)組用808 nm激光器照射1 ml的ZnxNi1-xS@DOX溶液(1×103mg/L)。每照射5 min后將溶液離心，收集上清液測定其熒光強(qiáng)度，隨后補(bǔ)充新鮮的PBS溶液，重新分散后在黑暗條件下保持相同時(shí)間，繼續(xù)離心收集上清液，重復(fù)此操作多次，分析其藥物釋放效果。

1.7 體外生物安全性評(píng)價(jià)使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)來評(píng)價(jià)ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的生物安全性。在96孔板中，接種處于對(duì)數(shù)生長期的HUVECs細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 d，然后加入不同濃度材料(0、20、40、60、80、100 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后加入MTT孵育4 h，使用150 μl二甲亞砜(DMSO)替換上層液體，測量490 nm處的吸光度值。

1.8 ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)的體外抗腫瘤效果檢測以小鼠乳腺癌細(xì)胞(mouse breast cancer cells, 4T1)為模型，通過MTT實(shí)驗(yàn)來評(píng)估ZnxNi1-xS@DOX 納米結(jié)構(gòu)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。操作過程同上。對(duì)于光照組，使用NIR光照射3 min(808 nm，2.0 W/cm2)。

2 結(jié)果

2.1 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的形貌表征掃描電鏡圖像及透射電鏡圖像均顯示ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)分散性良好且尺寸均一，平均直徑約為300 nm，見圖1A、B。掃描透射電子顯微鏡圖像顯示，Zn、Ni和S元素均勻的分布在ZnxNi1-xS空心納米球上，見圖1C～F。

圖1 ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的形貌表征a:ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖像 ×16 000；B: ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的透射電鏡圖像 ×15 000；C:ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的掃描透射電子顯微鏡圖像 ×200 000；D:Zn元素分布圖 ×200 000；E:Ni元素分布圖 ×200 000；F:S元素分布圖 ×200 000

2.2 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的粒徑測量和元素分析ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的水合粒徑約為317.98 nm，見圖2A。通過X射線光電子能譜儀對(duì)ZnxNi1-xS中Ni、Zn和S元素進(jìn)行分析。Zn 2p 1/2和Zn 2p 3/2軌道分別與1 043.25 eV和1 022.43 eV處的結(jié)合能相對(duì)應(yīng)。874.03 eV和857.01 eV處的結(jié)合能分別對(duì)應(yīng)Ni 2p 1/2和Ni 2p 3/2軌道，并在881.58 eV和863.05 eV處觀察到對(duì)應(yīng)的衛(wèi)星峰。此外，在162.21 eV及在168.76 eV處的結(jié)合能分別對(duì)應(yīng)S 2p軌道及S-O鍵。見圖2B～D。

圖2 ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的水合粒徑分布和元素圖譜a:水合粒徑分布；B:Zn 2p X射線光電子能譜圖；C:Ni 2p X射線光電子能譜圖；D:S 2p X射線光電子能譜圖

通過能量色散X射線光譜儀(energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX)對(duì)ZnxNi1-xS中Ni、Zn和S元素進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。Zn、Ni及S元素均存在于ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)中，具體的元素含量見表1，由此計(jì)算可得Zn ∶Ni ∶S的原子組成百分比約為1.64 ∶1 ∶1.78。

圖3 ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的EDX能譜

表1 ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的EDX元素比例分析(%)

2.3 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)光熱效應(yīng)ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出良好的光熱升溫效果，其光熱性能具有濃度依賴性，見圖4A、B。溶液濃度保持不變時(shí)(150 μg/ml)，激光功率越大，溶液溫度越高，光熱效果隨著激光功率的增大而增強(qiáng)，見圖4C。

圖4 ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)的光熱性能研究a:不同濃度的ZnxNi1-xS溶液在NIR光照射(808 nm, 2 W/cm2)下的溫度；B:對(duì)應(yīng)的紅外熱成像圖；C:不同功率NIR光照射下ZnxNi1-xS溶液的溫度

2.4 ZnxNi1-xS@DOX 納米結(jié)構(gòu)的合成紫外-可見吸收光譜顯示，ZnxNi1-xS可成功負(fù)載DOX分子，見圖5A。為了確定載藥量，將ZnxNi1-xS和DOX反應(yīng)后離心的上清液收集并測量其熒光強(qiáng)度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，見圖5B、C。通過計(jì)算可得載藥率約為23.54%。

2.5 ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)中DOX的響應(yīng)釋放探究了溫度和pH值對(duì)ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)中DOX釋放行為的影響。結(jié)果顯示，DOX的釋放率隨pH降低、溫度升高而增加。當(dāng)介質(zhì)pH為5.0，溫度升高至45 ℃時(shí)，ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)中DOX的釋放率可達(dá)到約60%，見圖5D、E。接著研究了在NIR光驅(qū)動(dòng)下的藥物釋放行為，在NIR激光器打開狀態(tài)下，DOX的釋放速率明顯高于黑暗條件下的釋放率，見圖5F。

圖5 ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)的藥物響應(yīng)釋放研究a:樣品的紫外-可見吸收光譜；B:不同濃度DOX的熒光光譜；C:對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；D、F:不同溫度、pH下DOX的釋放曲線；F:NIR光照射下DOX的釋放曲線

2.6 ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的生物安全性評(píng)價(jià)通過細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估了ZnxNi1-xS空心納米結(jié)構(gòu)的生物安全性。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HUVECs細(xì)胞的存活率整體均高于80%，見圖6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.04，P<0.001)。這表明ZnxNi1-xS納米粒子具有良好的生物安全性。

圖6 不同濃度ZnxNi1-xS納米顆粒與HUVECs共同培養(yǎng)24 h細(xì)胞存活率與0 μg/ml比較：*P<0.05，***P<0.001

2.7 ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)的體外抗腫瘤效果檢測當(dāng)用NIR光照射時(shí)，隨著ZnxNi1-xS@DOX濃度的增加，4T1細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)濃度為100 μg/ml時(shí)，4T1細(xì)胞存活率僅為10%左右，表明ZnxNi1-xS@DOX能有效殺傷腫瘤細(xì)胞。而同等條件下無NIR光照射時(shí)，4T1的存活率保持在70%附近，見圖7。同等濃度下，比較有無NIR光照射時(shí)的細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.126、222.194、168.406、494.395、989.943，P<0.001)。這表明持續(xù)的NIR光照射能夠使治療部位溫度升高并促進(jìn)DOX的釋放，將光熱療法與化學(xué)療法相聯(lián)合，顯著地提高體外抗腫瘤效果。

圖7 不同濃度ZnxNi1-xS@DOX納米顆粒與4T1細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h細(xì)胞存活率與ZnxNi1-xS@DOX組比較：***P<0.001

3 討論

由于環(huán)境惡化及飲食習(xí)慣不健康等因素，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。手術(shù)切除、放療等常規(guī)的治療方法因其創(chuàng)傷較大、難以徹底清除病變組織、易于復(fù)發(fā)等局限性，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)實(shí)需求[9]。近年來，納米科技的快速發(fā)展為腫瘤的治療提供了新的選擇，PTT因其獨(dú)特優(yōu)勢已成為腫瘤治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在NIR光作用下，PTT能夠通過光熱劑在近紅外區(qū)的能量轉(zhuǎn)換作用，使腫瘤區(qū)域溫度快速升高，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[10-11]。然而，單一的PTT可能存在治療不徹底、用藥劑量大等局限性，為了進(jìn)一步提高抗腫瘤功效，可將PTT與化學(xué)療法聯(lián)合，構(gòu)造能夠進(jìn)行光熱-化學(xué)療法聯(lián)合治療的納米體系。

本研究使用溶劑熱法成功合成了ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)，該納米顆粒分散性良好且尺寸均一，平均直徑約為300 nm。光熱性能研究實(shí)驗(yàn)表明，ZnxNi1-xS溶液濃度為0、30、60、90、120、150 μg/ml時(shí)，NIR光持續(xù)照射10 min后，溫度分別升高至32.5、36.0、39.6、42.3、47.1、53.5 ℃，其光熱效果具有明顯的濃度依賴性。此外，其光熱性能還表現(xiàn)出功率依賴性，當(dāng)激光器功率為1.0、1.5、2.0 W/cm2時(shí)，溫度分別為28.98、45.10、53.50 ℃。以上表明所合成的ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)是一種良好的光熱納米材料。生物相容性評(píng)估表明ZnxNi1-xS納米結(jié)構(gòu)對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性，具有良好的生物安全性，能夠用于后續(xù)研究?；赯nxNi1-xS納米顆粒中空結(jié)構(gòu)的獨(dú)特優(yōu)勢，可將其作為載體，構(gòu)建藥物遞送體系，使其負(fù)載DOX得到ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)。通過改變溫度模擬光熱升溫，調(diào)節(jié)介質(zhì)pH值模擬腫瘤組織微酸性環(huán)境，探究DOX的釋放行為，藥物釋放結(jié)果表明，溫度升高、pH降低及NIR光照射都能顯著地提高DOX的釋放速率。當(dāng)介質(zhì)pH為5.0，溫度升高至45 ℃時(shí)，ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)的藥物的釋放率可達(dá)到約60%。此外，DOX的釋放行為還表現(xiàn)出NIR光響應(yīng)性，黑暗條件下釋放率約為13%，在NIR激光器打開狀態(tài)下，DOX的釋放速率約為46%，約為黑暗條件下的3.5倍，這可能是因?yàn)樵?08 nm激光器的照射下，ZnxNi1-xS的光熱效應(yīng)使得溶液溫度升高，促進(jìn)了DOX的釋放。MTT實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在NIR光照射下，ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)能夠更加顯著地殺傷腫瘤細(xì)胞，當(dāng)ZnxNi1-xS@DOX濃度為100 μg/ml時(shí)，無NIR光照射條件下，4T1的存活率約為70%，而NIR光照射下4T1細(xì)胞存活率約為10%，表明該材料具有良好的抗腫瘤功效，對(duì)于臨床治療具有重要意義。

綜上所述，ZnxNi1-xS@DOX納米結(jié)構(gòu)能夠有效的聯(lián)合光熱療法和化學(xué)療法，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，作為一種新型的抗腫瘤材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。