徐基杰 戴 健 朱彥華 陳 松 卓德華 李 檫 周 華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 201999）

急性心肌梗死（AMI）后缺血缺氧的環(huán)境是導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的主要原因。減少梗死區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)防止左室不良重構(gòu)和保留心臟功能具有重要意義［1］。雖然介入治療能開(kāi)通大的冠脈分支，挽救梗死的心肌，但是仍存在無(wú)復(fù)流、微循環(huán)障礙等問(wèn)題［2］。因此，通過(guò)藥物治療，提高缺血缺氧心肌細(xì)胞的抗凋亡能力，對(duì)于改善AMI預(yù)后具有重要意義。在本研究中，擬探索中藥鹿紅方對(duì)缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響，并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

鹿紅方由寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室提供，由鹿角15 g，紅花9 g，桂枝 9 g，黃芪30 g，黨參15 g和葶藶子30 g組成。鹿紅方水提物制備：將藥材加水浸泡1 h，先大火煮沸后再用小火煎煮1 h，18層紗布過(guò)濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過(guò)，合并2次藥液，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，在60℃真空干燥，干膏稱重，再研為均勻細(xì)粉，備用。

1.2 細(xì)胞株

心肌細(xì)胞購(gòu)自Lonza公司。

1.3 試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、無(wú)血清培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海易色公司；AMD3100，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；GAPDH antibody購(gòu)自天津三箭公司；SDF-1兔抗、CXCR4兔抗、Bcl-2兔抗購(gòu)自英國(guó)abcam公司；Bax兔抗，購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自日本松下公司；水浴恒溫?fù)u床購(gòu)自上海漢諾公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；超凈臺(tái)，購(gòu)自美國(guó)BioX公司；多功能酶標(biāo)儀T0-3型，購(gòu)自瑞士Tecan公司；-80℃冰箱，購(gòu)自日本Sanyo公司。

1.4 模型制備

缺血缺氧模型的制備參考Wohnsland等的報(bào)道［3］并加改進(jìn)。取1 mL凍存心肌細(xì)胞（1～10×107），常規(guī)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基，并置于37℃三氣培養(yǎng)箱中，設(shè)置氣體比例：氮?dú)?5%、二氧化碳5%。將混合氣體以流速10 L/Min通過(guò)三氣培養(yǎng)箱，至測(cè)氧儀檢測(cè)箱中氧氣體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)停止通氣。培養(yǎng)時(shí)間設(shè)0.5、1、1.5、2、2.5、3 h共6個(gè)點(diǎn)，分別用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性，以此確定缺血缺氧和藥物干預(yù)時(shí)間。發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪時(shí)間在1.5 h時(shí)即見(jiàn)大量細(xì)胞凋亡，提示造模成功，故本研究將氧糖剝奪和藥物干預(yù)時(shí)間設(shè)為1.5 h。見(jiàn)圖1。

圖1 不同缺血缺氧時(shí)間下心肌細(xì)胞OD值

1.5 鹿紅方干預(yù)濃度的確定

鹿紅方中劑量濃度根據(jù)臨床使用劑量換算，參照《細(xì)胞培養(yǎng)》［4］公式：試驗(yàn)藥物質(zhì)量濃度（μg/mL）=（藥物臨床常用劑量×平均體表面積/平均體質(zhì)量）×（100÷60）。平均體質(zhì)量按60 kg，平均體表面積按1.6 m2計(jì)算，鹿紅方臨床用常用劑量為4.5 g/（kg·d），代入公式得鹿紅方細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中劑量約200 μg/mL，設(shè)立低劑量組為100 μg/mL，高劑量為500 μg/mL及1 000 μg/mL，加藥時(shí)根據(jù)各分組（表1）的干預(yù)要求，配成相應(yīng)質(zhì)量濃度，以考察量效關(guān)系。

表1 鹿紅方對(duì)心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響的干預(yù)分組

1.6 分組及干預(yù)

首先探討不同濃度的鹿紅方處理，對(duì)缺血缺氧模型下心肌細(xì)胞抗凋亡能力的影響，分組和干預(yù)方式如表2所示。然后從SDF-1/CXCR4信號(hào)通路探討鹿紅方作用機(jī)制，分組和干預(yù)方式如表2所示。

表2 鹿紅方對(duì)心肌細(xì)胞抗凋亡能力影響機(jī)制研究的干預(yù)分組

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 CCK-8法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目 待測(cè)心肌細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（104細(xì)胞/孔），按分組加入干預(yù)藥物；然后加入10 μL CCK-8試劑，混勻后37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，測(cè)定450 nm處OD值；酶標(biāo)儀讀取待測(cè)樣品和空白參照在450 nm處的OD值，將各待測(cè)樣本的OD值記為測(cè)量值，空白參照的OD值記為空白值，終值=測(cè)量值-空白值；通過(guò)判定OD值的高低反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.7.2 Western blotting檢測(cè)心肌相關(guān)蛋白的表達(dá) 各組心肌細(xì)胞表達(dá)SDF-1、CXCR4、Bax以及Bcl-2蛋白的水平采用Western blotting法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法按照我們之前的研究進(jìn)行［5］。簡(jiǎn)述如下：蛋白用SDSPAGE提取分離，然后轉(zhuǎn)膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗，稀釋比如下：SDF-1 1∶1 000；CXCR4 1∶100；Bax 1∶3 000；Bcl-2 1∶500；過(guò)夜，室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞OD值比較

對(duì)照組與各造模組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），各造模組OD值顯著降低（P＜0.001）；鹿紅方低劑量組和模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量1組及高劑量2組和模型組及鹿紅方低劑量組比較，OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；鹿紅方中低劑量組、鹿紅方高劑量1組與高劑量2組之間OD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示鹿紅方200 μg/mL即可達(dá)到良好的抗凋亡效果，繼續(xù)提高質(zhì)量濃度并未顯示出療效的增強(qiáng)，因此，在后續(xù)機(jī)制研究中將鹿紅方的質(zhì)量濃度定為200 μg/mL。見(jiàn)表3。

表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較（%，±s）

表3 各組心肌細(xì)胞OD值比較（%，±s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.001。下同。

組別對(duì)照組模型組鹿紅方低劑量組鹿紅方中劑量組鹿紅方高劑量1組鹿紅方高劑量2組心肌細(xì)胞存活率0.89±0.01 0.21±0.02#0.20±0.03#0.46±0.02#*0.48±0.02#*0.45±0.01#*

2.2 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較

模型組與對(duì)照組比較，SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）；AMD中劑量組與模型組比較，SDF-1和CXCR4表達(dá)顯著升高（P＜0.001）；鹿紅方中劑量組與模型組比較，SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。見(jiàn)表4，圖2～圖3。

圖2 各組SDF-1蛋白表達(dá)量比較

圖3 各組CXCR4蛋白表達(dá)量比較

表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組心肌細(xì)胞SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)量比較（±s）

組別對(duì)照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組SDF-1/GAPDH 0.04±0.01 0.41±0.05#0.85±0.01#*0.68±0.02#*0.87±0.01#*CXCR4/GAPDH 0.05±0.01 0.37±0.07#0.76±0.04#*0.65±0.04#*0.79±0.08#*

2.3 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較

Western blotting結(jié)果顯示：模型組與對(duì)照組比較，Bax的表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）；AMD3100組與模型組比較，Bax表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)量有降低趨勢(shì)（P=0.061），Bax/Bcl-2值顯著升高（P＜0.001）；鹿紅方中劑量組與模型組比較，Bax表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)量顯著升高，Bax/Bcl-2值顯著降低（P＜0.001）；鹿紅方+AMD3100組與鹿紅方中劑量組比較，Bax表達(dá)量顯著升高，Bcl-2表達(dá)量顯著降低，Bax/Bcl-2值顯著升高（P＜0.001）。見(jiàn)表5，圖4～圖5。

表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較（±s）

表5 各組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與鹿紅方中劑量組比較，★P＜0.001。

組別對(duì)照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組Bax/GAPDH 0.02±0.01 0.69±0.08#0.78±0.05#*0.35±0.05#*0.61±0.04#★Bcl-2/GAPDH 0.12±0.01 0.29±0.03#0.23±0.04#0.57±0.05#*0.34±0.04#★Bax/Bcl-2 0.17±0.03 2.3±0.23#3.4±0.6#*0.62±0.14#*1.78±0.13#★

圖4 各組Bax蛋白表達(dá)條帶

圖5 各組Bcl-2蛋白表達(dá)條帶

3 討論

心肌梗死預(yù)后的改善有賴于更多心肌細(xì)胞的存活。及時(shí)的冠脈介入治療能挽救大部分心肌，但無(wú)復(fù)流、慢血流和微循環(huán)梗死等問(wèn)題仍然導(dǎo)致了一部分心肌細(xì)胞的凋亡［2］。研究顯示，SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在心肌細(xì)胞抗凋亡方面起著重要作用［6］。SDF-1屬于CXC趨化因子亞家族成員，分為SDF-1α和SDF-1β，兩者的差別在于前者比后者少4個(gè)氨基酸。CXCR4是SDF-1最主要的受體，為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，表達(dá)于多種細(xì)胞表面［7］。SDF-1與CXCR4結(jié)合后，可以通過(guò)后者的二聚變構(gòu)和內(nèi)在化激活下游多條信號(hào)通路，參與提高細(xì)胞在缺血缺氧環(huán)境下的抗凋亡能力［8］。

在本研究中，我們以SDF-1/CXCR4信號(hào)通路為研究靶點(diǎn)，研究鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的部分機(jī)制。鹿紅方中鹿角溫補(bǔ)肝腎、補(bǔ)益精血，使腎氣有根，陽(yáng)氣上通于心，紅花活血化瘀通經(jīng)，兼涼血解毒，共為君藥；桂枝溫通心陽(yáng)；黃芪、黨參益氣扶正；葶藶子瀉肺平喘。諸藥合用，共奏溫補(bǔ)心腎陽(yáng)氣、活血利水之功效。心肌梗死后，罪犯血管堵塞，心梗區(qū)域缺氧無(wú)灌注的狀態(tài)當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“心血瘀阻”證范疇［9］，鹿紅方益氣活血的功效切合該病機(jī)。鹿紅方長(zhǎng)期在臨床應(yīng)用，在改善心衰，尤其是冠心病心衰臨床癥狀和預(yù)后方面，療效顯著。前期的臨床研究結(jié)果也提示，鹿紅方有確切的抗心衰臨床療效［10-12］，而其作用機(jī)制研究正不斷深入開(kāi)展。

現(xiàn)代藥理研究表明，組成本方的6味藥物均有不同程度的細(xì)胞保護(hù)和增強(qiáng)抗凋亡能力的作用：黃芪中的黃芪甲苷、紅花中的羥基紅花黃色素A有明確抗心肌細(xì)胞凋亡的作用［13-14］，葶藶子有效成分能顯著改善缺氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激失衡狀態(tài)［15］；桂枝有效成分肉桂酸具有保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的作用［16］；鹿角蛋白具有保護(hù)急性缺血時(shí)心肌微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用［17］；黨參內(nèi)酯可通過(guò)作用于胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ受體減少心肌細(xì)胞凋亡［18］。

本研究結(jié)果顯示，模型組SDF-1和CXCR4蛋白表達(dá)水平顯著上升。這是因?yàn)樵谌毖毖醐h(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）家族成員激活，后者可直接調(diào)控一些生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、生長(zhǎng)因子（HGF）等，其中還包括化學(xué)趨化因子如SDF-1的轉(zhuǎn)錄［19-21］。在缺血、缺氧時(shí)，SDF-1的表達(dá)在HIF-1的作用下得到上調(diào)；而CXCR4也在HIF-1的介導(dǎo)下表達(dá)增加，從而使SDF-1與CXCR4結(jié)合增加，激活下游信號(hào)通路發(fā)揮抗缺血缺氧效應(yīng)［19］。本研究結(jié)果顯示的缺血缺氧激發(fā)心肌細(xì)胞分泌SDF-1和CXCR4的效應(yīng)與前期研究報(bào)道一致［22］。

用CXCR4受體拮抗劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4通路后，Bax的表達(dá)顯著升高，Bcl-2的表達(dá)顯著降低，Bax/Bcl-2數(shù)值升高，表明凋亡程度加重，從反面驗(yàn)證了SDF-1/CXCR4信號(hào)通路激活對(duì)心肌細(xì)胞在缺血、缺氧應(yīng)激下的抗凋亡效應(yīng)。同時(shí)，我們注意到AMD3100組SDF-1和CXCR4的表達(dá)顯著上升，這可能是因?yàn)樽钄鄡烧呓Y(jié)合后，信號(hào)通路的下游關(guān)鍵蛋白的磷酸化受阻，細(xì)胞內(nèi)可能存在某種反饋系統(tǒng)，刺激SDF-1和CXCR4的分泌，值得進(jìn)一步研究。鹿紅組與模型組比較，SDF-1/CXCR4表達(dá)顯著上升，同時(shí)Bax的表達(dá)顯著降低，Bcl-2的表達(dá)顯著升高，Bax/Bcl-2數(shù)值降低，提示鹿紅方可通過(guò)上調(diào)SDF-1/CXCR4軸的表達(dá)，提高心肌細(xì)胞的抗凋亡能力。在用AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4信號(hào)通路后，鹿紅方提高心肌細(xì)胞抗凋亡能力的作用受到抑制，從反面說(shuō)明鹿紅方發(fā)揮作用的機(jī)制部分是通過(guò)上調(diào)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，鹿紅方可提高缺血缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的抗凋亡能力，其機(jī)制與上調(diào)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路有關(guān)。本研究的結(jié)果為鹿紅方的臨床應(yīng)用提供了一定的生物學(xué)依據(jù)，但進(jìn)一步的作用機(jī)制有待更深入的研究。