徐基杰 戴 健 朱彥華 陳 松 卓德華 李 檫 周 華

（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 201999）

急性心肌梗死（AMI）后缺血缺氧的環(huán)境是導致心肌細胞凋亡的主要原因。減少梗死區(qū)域心肌細胞的凋亡對防止左室不良重構和保留心臟功能具有重要意義［1］。雖然介入治療能開通大的冠脈分支，挽救梗死的心肌，但是仍存在無復流、微循環(huán)障礙等問題［2］。因此，通過藥物治療，提高缺血缺氧心肌細胞的抗凋亡能力，對于改善AMI預后具有重要意義。在本研究中，擬探索中藥鹿紅方對缺血缺氧模型下心肌細胞抗凋亡能力的影響，并進行初步的機制探討。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

鹿紅方由寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室提供，由鹿角15 g，紅花9 g，桂枝 9 g，黃芪30 g，黨參15 g和葶藶子30 g組成。鹿紅方水提物制備：將藥材加水浸泡1 h，先大火煮沸后再用小火煎煮1 h，18層紗布過濾，濾液備用；另外再加適量水同法再煎煮1次，18層紗布濾過，合并2次藥液，于60℃旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，在60℃真空干燥，干膏稱重，再研為均勻細粉，備用。

1.2 細胞株

心肌細胞購自Lonza公司。

1.3 試劑與儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、無血清培養(yǎng)基均購自美國GIBCO公司；CCK-8試劑盒購自上海易色公司；AMD3100，購自美國Sigma公司；GAPDH antibody購自天津三箭公司；SDF-1兔抗、CXCR4兔抗、Bcl-2兔抗購自英國abcam公司；Bax兔抗，購自美國Proteintech公司。三氣培養(yǎng)箱購自日本松下公司；水浴恒溫搖床購自上海漢諾公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，購自美國Thermo公司；超凈臺，購自美國BioX公司；多功能酶標儀T0-3型，購自瑞士Tecan公司；-80℃冰箱，購自日本Sanyo公司。

1.4 模型制備

缺血缺氧模型的制備參考Wohnsland等的報道［3］并加改進。取1 mL凍存心肌細胞（1～10×107），常規(guī)復蘇后轉移至無血清培養(yǎng)基，并置于37℃三氣培養(yǎng)箱中，設置氣體比例：氮氣95%、二氧化碳5%。將混合氣體以流速10 L/Min通過三氣培養(yǎng)箱，至測氧儀檢測箱中氧氣體積分數(shù)為3%時停止通氣。培養(yǎng)時間設0.5、1、1.5、2、2.5、3 h共6個點，分別用CCK-8檢測細胞活性，以此確定缺血缺氧和藥物干預時間。發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪時間在1.5 h時即見大量細胞凋亡，提示造模成功，故本研究將氧糖剝奪和藥物干預時間設為1.5 h。見圖1。

圖1 不同缺血缺氧時間下心肌細胞OD值

1.5 鹿紅方干預濃度的確定

鹿紅方中劑量濃度根據(jù)臨床使用劑量換算，參照《細胞培養(yǎng)》［4］公式：試驗藥物質量濃度（μg/mL）=（藥物臨床常用劑量×平均體表面積/平均體質量）×（100÷60）。平均體質量按60 kg，平均體表面積按1.6 m2計算，鹿紅方臨床用常用劑量為4.5 g/（kg·d），代入公式得鹿紅方細胞實驗中劑量約200 μg/mL，設立低劑量組為100 μg/mL，高劑量為500 μg/mL及1 000 μg/mL，加藥時根據(jù)各分組（表1）的干預要求，配成相應質量濃度，以考察量效關系。

表1 鹿紅方對心肌細胞抗凋亡能力影響的干預分組

1.6 分組及干預

首先探討不同濃度的鹿紅方處理，對缺血缺氧模型下心肌細胞抗凋亡能力的影響，分組和干預方式如表2所示。然后從SDF-1/CXCR4信號通路探討鹿紅方作用機制，分組和干預方式如表2所示。

表2 鹿紅方對心肌細胞抗凋亡能力影響機制研究的干預分組

1.7 檢測指標

1.7.1 CCK-8法測定活細胞數(shù)目 待測心肌細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（104細胞/孔），按分組加入干預藥物；然后加入10 μL CCK-8試劑，混勻后37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，測定450 nm處OD值；酶標儀讀取待測樣品和空白參照在450 nm處的OD值，將各待測樣本的OD值記為測量值，空白參照的OD值記為空白值，終值=測量值-空白值；通過判定OD值的高低反映活細胞數(shù)量。

1.7.2 Western blotting檢測心肌相關蛋白的表達 各組心肌細胞表達SDF-1、CXCR4、Bax以及Bcl-2蛋白的水平采用Western blotting法進行測定。測定方法按照我們之前的研究進行［5］。簡述如下：蛋白用SDSPAGE提取分離，然后轉膜至聚乙烯二氟膜上。孵育一抗，稀釋比如下：SDF-1 1∶1 000；CXCR4 1∶100；Bax 1∶3 000；Bcl-2 1∶500；過夜，室溫下孵育二抗1 h。最后采用灰度值半定量法分析蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞OD值比較

對照組與各造模組OD值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），各造模組OD值顯著降低（P＜0.001）；鹿紅方低劑量組和模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；鹿紅方中劑量組、鹿紅方高劑量1組及高劑量2組和模型組及鹿紅方低劑量組比較，OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；鹿紅方中低劑量組、鹿紅方高劑量1組與高劑量2組之間OD差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示鹿紅方200 μg/mL即可達到良好的抗凋亡效果，繼續(xù)提高質量濃度并未顯示出療效的增強，因此，在后續(xù)機制研究中將鹿紅方的質量濃度定為200 μg/mL。見表3。

表3 各組心肌細胞OD值比較（%，±s）

表3 各組心肌細胞OD值比較（%，±s）

注：與對照組比較，#P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.001。下同。

組別對照組模型組鹿紅方低劑量組鹿紅方中劑量組鹿紅方高劑量1組鹿紅方高劑量2組心肌細胞存活率0.89±0.01 0.21±0.02#0.20±0.03#0.46±0.02#*0.48±0.02#*0.45±0.01#*

2.2 各組心肌細胞SDF-1、CXCR4蛋白表達量比較

模型組與對照組比較，SDF-1和CXCR4的表達顯著升高（P＜0.001）；AMD中劑量組與模型組比較，SDF-1和CXCR4表達顯著升高（P＜0.001）；鹿紅方中劑量組與模型組比較，SDF-1和CXCR4的表達顯著升高（P＜0.001）。見表4，圖2～圖3。

圖2 各組SDF-1蛋白表達量比較

圖3 各組CXCR4蛋白表達量比較

表4 各組心肌細胞SDF-1、CXCR4蛋白表達量比較（±s）

表4 各組心肌細胞SDF-1、CXCR4蛋白表達量比較（±s）

組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組SDF-1/GAPDH 0.04±0.01 0.41±0.05#0.85±0.01#*0.68±0.02#*0.87±0.01#*CXCR4/GAPDH 0.05±0.01 0.37±0.07#0.76±0.04#*0.65±0.04#*0.79±0.08#*

2.3 各組心肌細胞Bax及Bcl-2蛋白表達量比較

Western blotting結果顯示：模型組與對照組比較，Bax的表達量顯著升高（P＜0.001）；AMD3100組與模型組比較，Bax表達量顯著升高（P＜0.05），Bcl-2表達量有降低趨勢（P=0.061），Bax/Bcl-2值顯著升高（P＜0.001）；鹿紅方中劑量組與模型組比較，Bax表達顯著降低，Bcl-2表達量顯著升高，Bax/Bcl-2值顯著降低（P＜0.001）；鹿紅方+AMD3100組與鹿紅方中劑量組比較，Bax表達量顯著升高，Bcl-2表達量顯著降低，Bax/Bcl-2值顯著升高（P＜0.001）。見表5，圖4～圖5。

表5 各組心肌細胞Bax及Bcl-2蛋白表達量比較（±s）

表5 各組心肌細胞Bax及Bcl-2蛋白表達量比較（±s）

注：與鹿紅方中劑量組比較，★P＜0.001。

組別對照組模型組AMD3100組鹿紅方中劑量組鹿紅方+AMD3100組Bax/GAPDH 0.02±0.01 0.69±0.08#0.78±0.05#*0.35±0.05#*0.61±0.04#★Bcl-2/GAPDH 0.12±0.01 0.29±0.03#0.23±0.04#0.57±0.05#*0.34±0.04#★Bax/Bcl-2 0.17±0.03 2.3±0.23#3.4±0.6#*0.62±0.14#*1.78±0.13#★

圖4 各組Bax蛋白表達條帶

圖5 各組Bcl-2蛋白表達條帶

3 討論

心肌梗死預后的改善有賴于更多心肌細胞的存活。及時的冠脈介入治療能挽救大部分心肌，但無復流、慢血流和微循環(huán)梗死等問題仍然導致了一部分心肌細胞的凋亡［2］。研究顯示，SDF-1/CXCR4信號通路在心肌細胞抗凋亡方面起著重要作用［6］。SDF-1屬于CXC趨化因子亞家族成員，分為SDF-1α和SDF-1β，兩者的差別在于前者比后者少4個氨基酸。CXCR4是SDF-1最主要的受體，為7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，表達于多種細胞表面［7］。SDF-1與CXCR4結合后，可以通過后者的二聚變構和內在化激活下游多條信號通路，參與提高細胞在缺血缺氧環(huán)境下的抗凋亡能力［8］。

在本研究中，我們以SDF-1/CXCR4信號通路為研究靶點，研究鹿紅方提高心肌細胞抗凋亡能力的部分機制。鹿紅方中鹿角溫補肝腎、補益精血，使腎氣有根，陽氣上通于心，紅花活血化瘀通經(jīng)，兼涼血解毒，共為君藥；桂枝溫通心陽；黃芪、黨參益氣扶正；葶藶子瀉肺平喘。諸藥合用，共奏溫補心腎陽氣、活血利水之功效。心肌梗死后，罪犯血管堵塞，心梗區(qū)域缺氧無灌注的狀態(tài)當屬中醫(yī)學“心血瘀阻”證范疇［9］，鹿紅方益氣活血的功效切合該病機。鹿紅方長期在臨床應用，在改善心衰，尤其是冠心病心衰臨床癥狀和預后方面，療效顯著。前期的臨床研究結果也提示，鹿紅方有確切的抗心衰臨床療效［10-12］，而其作用機制研究正不斷深入開展。

現(xiàn)代藥理研究表明，組成本方的6味藥物均有不同程度的細胞保護和增強抗凋亡能力的作用：黃芪中的黃芪甲苷、紅花中的羥基紅花黃色素A有明確抗心肌細胞凋亡的作用［13-14］，葶藶子有效成分能顯著改善缺氧心肌細胞氧化應激失衡狀態(tài)［15］；桂枝有效成分肉桂酸具有保護心肌梗死后心肌細胞損傷的作用［16］；鹿角蛋白具有保護急性缺血時心肌微循環(huán)血管內皮細胞的作用［17］；黨參內酯可通過作用于胰島素樣生長因子Ⅱ受體減少心肌細胞凋亡［18］。

本研究結果顯示，模型組SDF-1和CXCR4蛋白表達水平顯著上升。這是因為在缺血缺氧環(huán)境下，缺氧誘導因子（HIF）家族成員激活，后者可直接調控一些生長因子的轉錄，如血管內皮生長因子（VEGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、生長因子（HGF）等，其中還包括化學趨化因子如SDF-1的轉錄［19-21］。在缺血、缺氧時，SDF-1的表達在HIF-1的作用下得到上調；而CXCR4也在HIF-1的介導下表達增加，從而使SDF-1與CXCR4結合增加，激活下游信號通路發(fā)揮抗缺血缺氧效應［19］。本研究結果顯示的缺血缺氧激發(fā)心肌細胞分泌SDF-1和CXCR4的效應與前期研究報道一致［22］。

用CXCR4受體拮抗劑AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4通路后，Bax的表達顯著升高，Bcl-2的表達顯著降低，Bax/Bcl-2數(shù)值升高，表明凋亡程度加重，從反面驗證了SDF-1/CXCR4信號通路激活對心肌細胞在缺血、缺氧應激下的抗凋亡效應。同時，我們注意到AMD3100組SDF-1和CXCR4的表達顯著上升，這可能是因為阻斷兩者結合后，信號通路的下游關鍵蛋白的磷酸化受阻，細胞內可能存在某種反饋系統(tǒng)，刺激SDF-1和CXCR4的分泌，值得進一步研究。鹿紅組與模型組比較，SDF-1/CXCR4表達顯著上升，同時Bax的表達顯著降低，Bcl-2的表達顯著升高，Bax/Bcl-2數(shù)值降低，提示鹿紅方可通過上調SDF-1/CXCR4軸的表達，提高心肌細胞的抗凋亡能力。在用AMD3100拮抗SDF-1/CXCR4信號通路后，鹿紅方提高心肌細胞抗凋亡能力的作用受到抑制，從反面說明鹿紅方發(fā)揮作用的機制部分是通過上調SDF-1/CXCR4信號通路的表達實現(xiàn)的。

綜上所述，鹿紅方可提高缺血缺氧狀態(tài)下心肌細胞的抗凋亡能力，其機制與上調SDF-1/CXCR4信號通路有關。本研究的結果為鹿紅方的臨床應用提供了一定的生物學依據(jù)，但進一步的作用機制有待更深入的研究。