張雪梅,韓 冰,蔣曉梅,劉明軍

(新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830026)

在綿羊品種改良和遺傳育種進(jìn)程中,毛色作為品種的重要特征,在確定雜交組合、品種純度及親緣關(guān)系鑒定等方面發(fā)揮著重要作用。動(dòng)物毛色遺傳研究是動(dòng)物表型變化遺傳機(jī)理研究的最好模型[1]。哺乳動(dòng)物毛色由多個(gè)基因決定,不僅單個(gè)基因在發(fā)生突變后可影響毛色形成;而且多個(gè)基因通過相互作用也能控制毛色形成[2],最終由控制毛色的各個(gè)候選基因共同作用形成各種單色毛和復(fù)色毛。

自第一個(gè)毛色基因TYRP1在小鼠中被克隆到現(xiàn)在[3],已被發(fā)現(xiàn)有170多個(gè)毛色相關(guān)基因在不同發(fā)育階段調(diào)控毛色的產(chǎn)生。在哺乳動(dòng)物中,黑色素形成的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜,從黑色素細(xì)胞的分化、成熟到黑色素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)過程需要多個(gè)基因參與調(diào)控[4]。毛發(fā)和皮膚的基本毛色是由真黑色素和褐黑素的比例和分布決定的[5]。Agouti基因作為控制動(dòng)物毛色的重要基因之一,通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合α-促黑色素細(xì)胞激素,抑制酪氨酸酶相關(guān)基因表達(dá),導(dǎo)致真黑色素合成減少,褐黑色素合成增加,抑制或減少ASIP基因表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)真黑素和褐黑素比例從而改變動(dòng)物毛色[6]。綿羊具有白色、紅棕色、灰色、黑色等多種毛色[7]。以往的研究表明,綿羊顯性白色表型與ASIP基因拷貝數(shù)變異和ASIP基因表達(dá)下調(diào)相關(guān)。在一些綿羊品種中,白色被毛是由于ASIP基因的190 kb串聯(lián)重復(fù),如澳大利亞美利奴羊。在美利奴羊中,ASIP基因本身存在的自然缺失突變類型很早就有記載。ASIP基因外顯子2上5 bp堿基的缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄框移碼隨后在第63位氨基酸翻譯提前終止,這被認(rèn)為是黑色被毛羊的隱性突變[8]。同樣地,ASIP基因外顯子2上9 bp堿基的缺失導(dǎo)致三肽丟失,可能影響轉(zhuǎn)運(yùn)前導(dǎo)序列的功能,這被認(rèn)為是黑色被毛羊的一個(gè)因果突變[9]。

隨著近幾年分子遺傳學(xué)和生物新技術(shù)的蓬勃發(fā)展,新技術(shù)、新成果在綿羊育種領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用,不僅突破了傳統(tǒng)育種無法解決的遺傳難題,而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定性狀的改變,大大提高了綿羊品種遺傳改良的速度[10]。在動(dòng)物個(gè)體上利用新型基因編輯技術(shù)進(jìn)行分子育種,可在較短時(shí)間獲得基因修飾動(dòng)物個(gè)體,再利用純合子動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行人工授精或自然交配實(shí)現(xiàn)群體逐步擴(kuò)繁,通過短短2～3代就可以建立起一定規(guī)模的穩(wěn)定遺傳家系,與雜交育種相比能夠極大地縮短育種時(shí)間,降低育種成本[11]。目前報(bào)道的關(guān)于哺乳動(dòng)物毛色遺傳學(xué)和生物學(xué)方面的研究,主要聚焦于全基因組學(xué)或編碼區(qū)上的SNP突變位點(diǎn)遺傳標(biāo)記方面的研究[12],但對(duì)于ASIP基因自然缺失突變和編輯修飾的遺傳學(xué)研究尚未見深入報(bào)道,因此本研究以F0、F1代ASIP基因編輯細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象,開展ASIP基因編輯羊自然突變和編輯基因型遺傳特征和規(guī)律的研究,為加速新疆細(xì)毛羊毛色性狀的選擇進(jìn)程、加快細(xì)毛羊毛色育種進(jìn)展提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在新疆畜牧科學(xué)院中-澳綿羊繁育基地選取具有不同毛色的ASIP基因編輯細(xì)毛羊包括F0代(6只)和F1代(23只)個(gè)體,用無菌剪刀、鑷子剪取羔羊小塊尾部皮膚組織放入離心管投于液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室,置于-20℃低溫冰箱保存,以備基因組DNA的提取。

1.2 雜交親本與雜交模式

課題組前期利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)中國(guó)美利奴細(xì)毛羊ASIP基因進(jìn)行編輯修飾后,獲得了具有不同毛色表型的F0代基因編輯羊,分別將具有深棕色毛色表型的F0代基因編輯公羊與19只白色表型野生型母羊、具有深色斑點(diǎn)表型的2只F0代基因編輯母羊與白色野生型公羊配種,分別獲得具有白色和深棕色毛色表型的后代21只、2只,共計(jì)23只F1代個(gè)體。

1.3 毛色記錄

記錄親本毛色和各雜交組合的后代毛色,大致分以下幾種毛色類型,分別為周身黑而頭頂白、周身棕腹部淺、黑白花、棕白花、全白,因具有黑/棕白花等毛色個(gè)體數(shù)量較少,故文章中將上述毛色分為兩大類:白色(全白)和非白色(全白色以外的其他毛色)。

1.4 主要試劑

組織DNA提取試劑盒、RNase、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司;p MD19-T載 體、T4連 接 酶、150 bp、1 000 bp DNA marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;2×EasyTaqPCR Super Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖購自Life Technologies公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成 按照NCBI數(shù)據(jù)庫中

發(fā)布的綿羊ASIP基因序列(登錄號(hào)為:NC_019470),采用Oligo 7.0軟件針對(duì)綿羊ASIP基因外顯子2序列設(shè)計(jì)特異性引物用于擴(kuò)增ASIP基因426 bp長(zhǎng)度的編碼區(qū),引物相關(guān)信息詳見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物名稱、引物序列、擴(kuò)增片段大小和最佳退火溫度Table 1 Primer,sequence,amplified fragment size and optimum annealing temperature

1.5.2 基因組DNA提取 用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(北京天根)提取綿羊尾組織基因組DNA,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,提取好的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),Nanodrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,將檢測(cè)合格的DNA稀釋至100 ng/μL,存于-20℃低溫冰箱。

1.5.3 PCR擴(kuò)增與DNA測(cè)序 PCR反應(yīng)總體系為50μL,包括2×PCR Master Mix 25μL,模板DNA 100 ng,上、下游引物(濃度10μmol/L)各1μL,滅菌超純水補(bǔ)足至50μL。PCR擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5.4 序列比對(duì)和同源性分析 樣品測(cè)序結(jié)果用Chromas和Clustalx軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析,用Primer Premier 5.0軟件翻譯編碼區(qū)氨基酸。1.5.5 克隆測(cè)序 根據(jù)DNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果,將具有重疊峰樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與p MD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆搖菌進(jìn)行單克隆測(cè)序。每個(gè)樣本隨機(jī)選取至少50個(gè)菌落,用M13引物進(jìn)行測(cè)序,最后將樣品測(cè)序結(jié)果與野生型序列進(jìn)行比對(duì)鑒定確定發(fā)生編輯的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 F0、F1代個(gè)體編輯位點(diǎn)的檢測(cè)和編輯基因型分析

根據(jù)上述設(shè)計(jì)的引物分別對(duì)6只F0代、23只F1代羔羊基因組進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠120 V電泳10 min檢測(cè)顯示在約426 bp處出現(xiàn)清晰條帶,電泳示意結(jié)果見圖1-A,B。

將PCR產(chǎn)物純化后送測(cè)序,通過Sanger測(cè)序法分析F0代個(gè)體以及由F0代公羊與野生型母羊配種獲得的F1代不同毛色綿羊個(gè)體的基因型,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì),結(jié)合Chromas軟件觀察測(cè)序的峰圖,確定基因的插入、缺失和刪除情況。結(jié)果顯示5只F0代、17只F1代共計(jì)22只個(gè)體的測(cè)序峰圖在PAM序列附近都出現(xiàn)了雜亂的雙/套峰且序列紊亂無序,其余7只個(gè)體的測(cè)序峰圖均為單一峰,序列有序且與野生型序列一致。將發(fā)生雙/套峰樣品經(jīng)3%瓊脂糖凝膠90V電泳50 min后顯示在目的條帶附近出現(xiàn)2～3條帶,說明靶點(diǎn)DNA序列存在突變,表明上述22只綿羊發(fā)生了ASIP基因編輯(圖1-C)。

圖1 ASIP基 因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification of ASIP gene

PCR測(cè)序結(jié)合T-A克隆測(cè)序結(jié)果表明,5只F0代非白色毛色綿羊中共鑒定出11種插入/缺失編輯形式,主要的編輯基因型有5種,其中F0代4只母羊主要有2種基因型:4 bp(～153-156,TATC)堿基缺失和2 bp(～154-155/155-156,AT/TC)堿基缺失,2種基因型在F0代4只母羊中所占比例分別為45%和29.5%;F0代僅有的1只公羊TG110主要有3種基因型:4 bp(～153-156,TATC)堿基缺失、27 bp(～136-160且跨越3個(gè)內(nèi)含子ATTTCCCTTCTGTCTCTATCGTGGGTA))堿基缺失和5 bp,12 bp(～153-154,TCCTC;～154-155,TGTTCCCTTCTG)堿基插入,3種基因型在F0代公羊中所占比例分別為29%、29%和24%。而且,每只編輯綿羊至少發(fā)生了2種修飾,即使是具有相似編輯修飾的羔羊,也表現(xiàn)出不同的毛色圖案。

獲得的17只F1代基因編輯羊個(gè)體中有5只個(gè)體的基因型為4 bp堿基缺失;有5只個(gè)體的基因型為27 bp堿基缺失和1 bp堿基插入;有3只個(gè)體的基因型為5 bp,12 bp堿基插入;有2只個(gè)體的基因型為21 bp(～142-160且跨越3個(gè)內(nèi)含子,CTTCTGTCTCTATCGTGGGTA)堿基缺失和+2 bp(～154-155,AA)堿基插入(表2)。由F0代母羊與野生公羊配種獲得的2只F1代不同毛色基因編輯羊個(gè)體的基因型均為2 bp(～154-155,AT)堿基缺失。綜上所述,F1代基因編輯羊主要有4種基因型,分別是4 bp堿基缺失、5 bp,12 bp堿基插入、27 bp堿基缺失伴隨1 bp堿基插入及2 bp堿基缺失為主要編輯類型,在F1代個(gè)體中所占比例分別為42.80%、36.00%、23.33%和37.00%,上述4種主要基因型測(cè)序結(jié)果見圖2。總體來說,F0代的幾種主要基因型基本穩(wěn)定遺傳給F1代個(gè)體。

圖2 ASIP基因編輯基因型分析Fig.2 ASIP gene editing genotype analysis

表2 F1 代基因編輯羊基因型和毛色表型結(jié)果Table 2 The results of sheep genotypes and coat color phenotypes in F1 gene edited sheep

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),4 bp堿基缺失、2 bp堿基插入、5 bp,12 bp堿基插入、2 bp堿基缺失和1 bp堿基插入導(dǎo)致讀碼框分別在第54位、56位、61位、65位和66位氨基酸處發(fā)生提前終止,導(dǎo)致產(chǎn)生一個(gè)個(gè)被截短的ASIP蛋白。而27 bp堿基缺失和21 bp堿基缺失發(fā)生在exon2和intron2的外顯子/內(nèi)含子交界處,可能會(huì)破壞ASIP轉(zhuǎn)錄的剪接(圖3)。

圖3 F1代基因編輯羊的自然突變和sgRNA/Cas9靶向修飾示意圖Fig.3 Natural mutation and Schematic diagram of targeted modification of sgRNA/Cas9 in F1 gene edited sheep

2.2 F0、F1代個(gè)體自然突變(D9和D5)的基因分型及與毛色關(guān)系研究

由圖4可知,PCR產(chǎn)物測(cè)序在鑒定編輯基因型的同時(shí)也檢測(cè)到ASIP基因外顯子2區(qū)域的2個(gè)缺失突變,9 bp堿基缺失的2個(gè)等位基因分別標(biāo)記為N9(g.10-18/AGCCGCCTC)和D9(deletion);5 bp堿基缺失的2個(gè)等位基因分別命名為N5(g.100-104/AGGAA)和D5(deletion)。由于自然突變?cè)斐傻腄9、D5自然突變?cè)趕g RNA靶點(diǎn)之前,以及綿羊ASIP基因組上190 kb的串聯(lián)重復(fù)造成的ASIP基因重復(fù),僅對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序很難確定CRISPR/Cas9編輯的準(zhǔn)確基因型,因此需要進(jìn)一步通過T-A克隆測(cè)序驗(yàn)證。

圖4 ASIP基因第2外顯子自然缺失突變測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of natural deletion mutation in exon 2 of ASIP gene

以往的研究發(fā)現(xiàn),在一些綿羊品種中D9和/或D5的自發(fā)突變頻率較高[5]。因此,通過對(duì)基因編輯羊個(gè)體進(jìn)行D9和D5缺失(D為突變,N為野生型)突變的基因型分析,結(jié)果表明F0、F1代基因編輯羊都存在D5和D9缺失突變等位基因。5 bp堿基缺失突變位點(diǎn)內(nèi),5只F0代基因編輯羊個(gè)體中3只具有N5D5雜合基因型,2只具有N5N5純合基因型;17只F1代基因編輯羊個(gè)體中9只具有N5D5雜合基因型,8只具有N5N5純合基因型。9 bp堿基缺失突變位點(diǎn)內(nèi),5只F0代基因編輯羊個(gè)體中1只具有N9D9雜合基因型,4只具有N9N9純合基因型;17只F1代基因編輯羊個(gè)體中3只具有N9D9雜合基因型,14只具有N9N9純合基因型(表3)?？傮w來說,F0、F1代基因編輯羊在2個(gè)缺失突變位點(diǎn)上僅存在純合基因型(包括N5N5,N9N9)和雜合基因型(包括N5D5,N9D9),未檢測(cè)到2個(gè)缺失突變位點(diǎn)同時(shí)存在的個(gè)體。正如張恒等[6]先前報(bào)道的結(jié)果,在D9或D5中,白色美利奴羊的這2種缺失都不是純合的。

本試驗(yàn)同時(shí)篩查了基因編輯羊的母本、父本及F1代本身的缺失突變基因型,發(fā)現(xiàn)父母本的缺失突變基因型發(fā)生分離且穩(wěn)定遺傳給了F1代。此外,F0代、F1代基因編輯羊和F1代母本(野生母羊)的ASIP基因第2外顯子9 bp堿基缺失突變位點(diǎn)內(nèi),都以純合基因型N9N9為優(yōu)勢(shì)基因型;5 bp堿基缺失突變位點(diǎn)內(nèi),F1代母本(野生母羊)以雜合基因型N5D5為優(yōu)勢(shì)基因型,而F0代、F1代基因編輯羊個(gè)體的純合基因型N5N5和雜合基因型N5D5數(shù)量相差不大(表3)。

表3 ASIP基因自然缺失突變?cè)贔0、F1代 基因編輯細(xì)毛羊的基因型和頻率Table 3 Genotypes and frequencies of natural deletion mutations of ASIP gene in F0 and F1 gene edited sheep

2.3 ASIP基因突變與毛色表型的相關(guān)性分析

在6只出生的羔羊中,5只羔羊鑒定出11種插入/缺失編輯形式。每只編輯羔羊至少發(fā)生2種修飾,并且發(fā)生多種修飾的編輯羔羊也呈現(xiàn)不同的毛色圖案,其中主要編輯形式4 bp堿基缺失的3只羔羊中,2只羔羊毛色圖案為周身黑色,頭頂部有白色斑點(diǎn);另一只羔羊毛色為周身棕色、腹部淺色的圖案。另2只黑白斑點(diǎn)圖案的羔羊其編輯形式主要為2 bp堿基缺失。

由表4可知,將具有毛色表型的F0代公羊與野生型母羊配種,獲得了15只雜交F1代基因編輯羊,10只均為周身白色。其中1只周身白,耳朵處有雜毛,2只后代黑白相間,1只后代周身棕、蹄黑、頭部白,1只個(gè)體后代四肢黑色,周身白,眼窩黑色。上述有毛色表型的雜交F1代個(gè)體與F0代公羊表型相似度較高,而且F1代同窩個(gè)體也并不一定具有相同基因型和毛色。將具有毛色表型的F0代母羊與野生公羊配種,獲得2只雜交F1代基因編輯羊,均為白色(表2,圖1)?？傮w來看,獲得雜交F1代個(gè)體以白色為主(71%,12/17),29%(5/17)個(gè)體具有毛色表型。

表4 F1代毛色分離的性別差異Table 4 Gender differences of coat color separation in F1 generation

3 討論與結(jié)論

ASIP基因在控制哺乳動(dòng)物色素轉(zhuǎn)變過程中起著十分重要的作用[13]。綿羊的ASIP基因位于13號(hào)染色體,該基因在綿羊基因組中存在多個(gè)拷貝和多個(gè)等位基因。研究發(fā)現(xiàn),不同品種綿羊ASIP基因SNP位點(diǎn)具有差異性:藏羊的ASIP基因外顯子2僅存在5 bp堿基缺失,只有D5N5和N5N52種基因型[14];澳大利亞美利奴羊[9]、哈薩克羊[15]外顯子2同時(shí)存在5 bp和9 bp堿基缺失。研究表明,美利奴羊的白色是由于ASIP基因的一段190 kb基因組串聯(lián)片段決定,由于拷貝數(shù)變異使有功能的ASIP編碼序列受到多個(gè)與之鄰近ITCH位點(diǎn)的起調(diào)控作用啟動(dòng)區(qū)的作用,引起位于下游的ASIP基因表達(dá),導(dǎo)致顯性白色表型,而黑色綿羊ASIP基因不表達(dá)。Gratten等[16]發(fā)現(xiàn)ASIP基因第2外顯子上5 bp堿基缺失和第4外顯子g.5172T＞A非同義突變影響了野生索厄羊的黑色被毛表型。Li等[17]的研究確定了ASIP基因是造成芬蘭羊白色與非白色毛色變異的主要候選基因。孟浩浩等[18]研究發(fā)現(xiàn)阿勒泰羊ASIP基因的5 bp堿基缺失與被毛毛色不相關(guān)(P＞0.05),而新疆細(xì)毛羊的ASIP基因的5 bp堿基缺失與被毛毛色極顯著相關(guān)(P＜0.01)。在本試驗(yàn)中,基因編輯細(xì)毛羊ASIP基因外顯子2僅存在純合基因型(包括N5N5,N9N9)和雜合基因型(包括N5D5,N9D9),未檢測(cè)到2個(gè)缺失突變位點(diǎn)同時(shí)存在的個(gè)體。

根據(jù)之前的研究[9],所有的白色美利奴羊有多個(gè)拷貝ASIP等位基因,而所有的隱性黑色美利奴羊只有一個(gè)單拷貝等位基因。對(duì)于由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源末端連接,在任何靶向等位基因可能隨機(jī)發(fā)生修飾,每個(gè)等位基因可能有不同的修飾。因此,CRISPR/Cas9在多個(gè)拷貝基因中進(jìn)行的修飾也具有多態(tài)性。在本試驗(yàn)中,由于ASIP基因的多拷貝性,相同編輯類型的基因編輯羊也呈現(xiàn)不同毛色表型。如編輯基因型均為4 bp堿基缺失,自然突變均為D5N5雜合基因型的個(gè)體,其毛色有的呈現(xiàn)白色,有的呈現(xiàn)周身白,四肢和眼窩黑的圖案,很可能是發(fā)生編輯的位置在不同的拷貝上,不同編輯類型在不同拷貝上的位置也可能導(dǎo)致同一編輯類型在不同個(gè)體出現(xiàn)多種毛色表型。因此,推測(cè)可能是由于ASIP基因的自然突變、不同的編輯修飾和ASIP多拷貝基因的串聯(lián)重復(fù)三者共同作用使ASIP基因編輯羊的基因型和表型遺傳呈現(xiàn)多樣性。

隨著新型基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展,有望從細(xì)胞或個(gè)體水平深入研究毛色候選基因的不同突變類型在細(xì)胞或個(gè)體水平造成的細(xì)胞色素化或毛色差異。而利用遺傳修飾技術(shù)在綿羊中進(jìn)行分子育種比傳統(tǒng)的育種方式具有更大的優(yōu)勢(shì),可以使用多種策略直接對(duì)性狀進(jìn)行快速改良,加快育種進(jìn)程,必將會(huì)在家畜育種新材料創(chuàng)制和疾病防控等方面發(fā)揮重要作用,同時(shí)也為揭示人類某些重大遺傳疾病的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。