張 妍,楊明珍
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種以造血干細(xì)胞異常生長(zhǎng)和分化為特征的惡性疾病,具有增殖、存活和分化異常的特點(diǎn)[1],據(jù)最新統(tǒng)計(jì),其死亡病例數(shù)占所有惡性腫瘤死亡病例的3.1%[2]。白血病常見(jiàn)的治療方法主要有化學(xué)治療、分子靶向治療及造血干細(xì)胞移植等治療手段。其死亡的主要原因仍然是化療耐藥導(dǎo)致的難治性或復(fù)發(fā)性疾病[3]?;钚匝?reactive oxygen species,ROS)是有氧呼吸的代謝副產(chǎn)物,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡。增高癌細(xì)胞ROS水平,會(huì)使其比正常細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[4]。去乙酰化酶3(sirtuin 3,Sirt3)是主要位于線粒體中的去乙?;福軌蛘{(diào)節(jié)異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2,IDH2)、ROS的表達(dá),可作為提高AML標(biāo)準(zhǔn)化療藥物療效的潛在治療靶點(diǎn)[5]?;诖?,該研究探討AML患者SIRT3、IDH2與ROS的表達(dá)及其在臨床診斷和療效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值,以期為臨床治療提供參考。
1.1 病例資料收集2020年10月—2021年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的新診斷的AML(非APL)患者20例作為新診斷組,其中男9例,女11例;18.00~86.00歲,中位年齡57.00歲。2例未進(jìn)行融合基因AML1-ETO檢測(cè),16例檢測(cè)陰性;2例患者融合基因AML1-ETO陽(yáng)性。治療后AML(非APL)患者40例作為經(jīng)治組,其中男22例,女18例;18.00~65.00歲,中位年齡51.50歲。7例未進(jìn)行融合基因AML1-ETO檢測(cè),25例檢測(cè)陰性;8例患者融合基因AML1-ETO陽(yáng)性。其中完全緩解者20例,部分緩解者20例。完全緩解者20例中,根據(jù)不同患者治療療程,以中位數(shù)6個(gè)療程為界,其中少于等于6個(gè)治療療程11例,高于6個(gè)治療療程9例。均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等檢測(cè)后確診為急性髓系白血病。20例正常人作為對(duì)照組。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)(批號(hào):PJ2021-16-14),以及取得患者知情同意。
1.1.1對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn) ① 血常規(guī)、肝腎功能無(wú)異常,既往無(wú)腫瘤史、自身免疫性疾病病史;② 排除合并其他腫瘤性、血液性、傳染性、免疫性疾病。
1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑IDH2 ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;SIRT3 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢基因美公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司;倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)蔡司公司。FBS胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、無(wú)水二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、Hank′s平衡鹽溶液(Hank′s balanced salt Solution,HBSS)、杜氏磷酸緩沖液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline,D-PBS)、 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)、線粒體綠色熒光探針(MITO-Tracker Green)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。
1.3 分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞常規(guī)骨髓穿刺,抽取新診斷組、經(jīng)治組患者及對(duì)照組骨髓液3 ml,加等量無(wú)菌PBS液用吸管反復(fù)吹打、充分混勻。加入等體積的分離液于無(wú)菌管中,將稀釋后的骨髓液緩慢平鋪到分離液上方,按照說(shuō)明離心后小心吸取中間的白膜層,加入PBS液,用吸管反復(fù)吹打、混勻、離心,去上清液后將細(xì)胞收集。
1.4 測(cè)量骨髓單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)以1 ∶2 000的比例用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,至終濃度為5 μmol/L。收集細(xì)胞,重懸于稀釋的DCFH-DA中,吹打均勻后置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行洗滌,以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)試劑。收集各組細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下觀察,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)各組平均熒光強(qiáng)度。并用Image J軟件分析。
1.5 測(cè)量骨髓單個(gè)核細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS表達(dá)Mito-Tracker Green用無(wú)水DMSO配制至終濃度為1 mmol/L,作為儲(chǔ)存液與HBSS按照比例配制成工作液。將各組已提取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞加入適量Mito-Tracker Green工作液,吹打均勻后37 ℃避光孵育30 min,離心取上清液,無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,全程避光,倒置熒光顯微鏡下觀察,監(jiān)測(cè)各組平均熒光濃度,并用Image J軟件分析。
1.6 ELISA方法檢測(cè)外周血血漿標(biāo)本IDH2、SIRT3的表達(dá)抽取新診斷組、經(jīng)治組患者及對(duì)照組外周血3 ml置于含檸檬酸鈉管中,常溫下1 500 r/min離心10 min,收集上清液;按試劑盒說(shuō)明測(cè)定外周血血漿IDH2、SIRT3的表達(dá)情況,并在平板閱讀器上于450 nm處立即測(cè)量吸光度。用二次多項(xiàng)式擬合曲線計(jì)算IDH2、SIRT3濃度。
1.7 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分析比較AML(非APL)各亞組患者實(shí)驗(yàn)室檢查、治療療效及不同治療療程中SIRT3的表達(dá)。
2.1 ROS在骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)相比較對(duì)照組,新診斷組中ROS表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相較于新診斷組,經(jīng)治組ROS表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。
圖1 三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞ROS表達(dá) ×200A:新診斷組;B:經(jīng)治組;C:對(duì)照組;D:三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與新診斷組比較:#P<0.05
2.2 ROS在骨髓單個(gè)核細(xì)胞線粒體中的表達(dá)相比較對(duì)照組,新診斷組ROS表達(dá)上調(diào)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相較于新診斷組,經(jīng)治組ROS表達(dá)表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。
圖2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS的表達(dá) ×200A:新診斷組;B:經(jīng)治組;C:對(duì)照組;D:三組骨髓單個(gè)核細(xì)胞線粒體平均熒光強(qiáng)度;與對(duì)照組比較:*P<0.05;與新診斷組比較:#P<0.05
2.3 各組間SIRT3、IDH2水平變化相較于對(duì)照組,新診斷組中IDH2的表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1);相較于新診斷組,經(jīng)治組中IDH2的表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);組間F=13.048,P<0.05。外周血標(biāo)本稀釋5倍后,相較于對(duì)照組,新診斷組中SIRT3的表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1);相較于新診斷組,經(jīng)治組中SIRT3的表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);組間F=17.740,P<0.05。見(jiàn)圖3。
圖3 各組間人血漿IDH2、SIRT3表達(dá)與對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1;與新診斷組比較:#P<0.05,##P<0.01
2.4 SIRT3表達(dá)水平與融合基因AML1-ETO的關(guān)系
2.4.1新診斷AML患者SIRT3表達(dá)水平與融合基因AML1-ETO的關(guān)系 20例新診斷AML患者中,2例未進(jìn)行融合基因檢測(cè),16例檢測(cè)陰性;2例患者融合基因陽(yáng)性。融合基因檢測(cè)陽(yáng)性組SIRT3表達(dá)為(626.73±11.89) ng/L,融合基因檢測(cè)陰性組SIRT3表達(dá)為(591.54±127.29) ng/L,比較融合基因陽(yáng)性組和陰性組AML患者SIRT3表達(dá)水平,結(jié)果顯示,兩組間SIRT3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.267,P>0.05)。
2.4.2經(jīng)治AML患者SIRT3表達(dá)水平與融合基因AML1-ETO的關(guān)系 40例經(jīng)治AML患者中,7例未進(jìn)行融合基因檢測(cè),25例檢測(cè)陰性;8例患者融合基因陽(yáng)性。融合基因檢測(cè)陽(yáng)性組SIRT3表達(dá)為(759.96±114.81) ng/L,融合基因檢測(cè)陰性組 SIRT3表達(dá)為(751.66±241.87) ng/L,比較融合基因陽(yáng)性組和陰性組AML患者SIRT3表達(dá)水平,結(jié)果顯示,兩組間SIRT3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.951,P>0.05)。
2.5 經(jīng)治患者SIRT3表達(dá)水平與治療療效之間的關(guān)系40例經(jīng)治AML患者中,其中完全緩解(CR)者20例,部分緩解(PR)者20例。完全緩解者,其SIRT3表達(dá)為(722.95±172.33) ng/L;部分緩解者,其SIRT3表達(dá)為(794.57±259.61) ng/L,完全緩解者與部分緩解者間SIRT3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.156,P>0.05)。
2.6 經(jīng)治CR患者SIRT3表達(dá)水平與治療療程之間的關(guān)系40例經(jīng)治AML患者中,其中完全緩解者20例,根據(jù)不同患者治療療程,以中位數(shù)6個(gè)療程為界,其中少于等于6個(gè)治療療程11例,其SIRT3表達(dá)為(712.79±183.43) ng/L;高于6個(gè)治療療程9例,其SIRT3表達(dá)為(735.36±167.82) ng/L,兩組間SIRT3表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.190,P>0.05)。
SIRT3主要分布于線粒體,不僅具有去乙酰酶活性,并且能夠靶向多條代謝途徑,調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常代謝和功能[6]。文獻(xiàn)報(bào)道,SIRT3的丟失,與高氧化應(yīng)激和ROS的產(chǎn)生以及代謝重編程有關(guān),且后者有助于癌癥的發(fā)生[7]。有研究[8]表明,外周血血清與腫瘤細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)有一定的相關(guān)性,且其可能成為腫瘤無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。本研究中,白血病患者外周血SIRT3含量均低于對(duì)照組,表明在急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展中,SIRT3可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化損傷,調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而已確診為AML的患者中,其中新診斷組低于經(jīng)治組,在經(jīng)治組中,PR亞組SIRT3水平高于CR亞組,而在經(jīng)治組中經(jīng)治療獲得CR的患者中,治療療程較短的亞組,其SIRT3水平低于治療療程長(zhǎng)的亞組,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,提示SIRT3高表達(dá)可能參與原發(fā)耐藥。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本量以明確。IDH2是三羧酸循環(huán)中一種關(guān)鍵酶,SIRT3可通過(guò)去乙?;疘DH2,以提高細(xì)胞抗氧化能力。研究[9]證明,將穩(wěn)定表達(dá)SIRT3的細(xì)胞中的IDH2基因敲除,會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激保護(hù)完全或幾乎完全喪失。本研究結(jié)果提示,急性髓系白血病患者IDH2表達(dá)均大于對(duì)照組,新診斷組表達(dá)大于經(jīng)治組,借此推斷白血病細(xì)胞氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡被打破,而不排除系SIRT3參與的協(xié)調(diào)作用。融合基因在疾病的診斷、預(yù)后及治療療效評(píng)估中起著重要的作用。本研究中,在新診斷及經(jīng)治患者中,SIRT3的表達(dá)與融合基因AML1-ETO陽(yáng)性與否無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。但是本研究中新診斷患者只有2例AML1-ETO基因陽(yáng)性,病例數(shù)較少,無(wú)法得出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不能明確說(shuō)明SIRT3的表達(dá)并不受其影響,需后期增大樣本量進(jìn)一步探究。
氧化應(yīng)激通常被定義為ROS生成和抗氧化防御系統(tǒng)受損之間的失衡。且已有研究[10]證明它與癌癥的病理生理學(xué)有關(guān)。本研究結(jié)果提示,60例已確診為急性髓系白血病患者細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)ROS水平均明顯高于對(duì)照組,與相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道相似,表明白血病細(xì)胞氧化還原平衡被打破,產(chǎn)生大量ROS。有研究顯示,血紅素加氧酶-1(haem oxygenase-1,HO-1)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞血紅素水平,增加抗氧化劑的生成。相較于健康對(duì)照組,AML患者的HO-1的表達(dá)下調(diào),但針對(duì)AML的兩種常用化療藥物阿糖胞苷和柔紅霉素在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,可以增加HO-1的表達(dá),與治療前對(duì)比有所恢復(fù)[12-13]。上述研究說(shuō)明,化療后的白血病細(xì)胞抗氧化能力較前提高。本研究中,經(jīng)治組患者白血病細(xì)胞ROS表達(dá)低于新診斷組,表明治療后患者細(xì)胞具有較前增高的抗氧化能力。低表達(dá)ROS的腫瘤細(xì)胞通常會(huì)表現(xiàn)出更高的耐藥性,在本研究中,新診斷組ROS表達(dá)高于經(jīng)治組,表明在經(jīng)多次化學(xué)治療后,治療療效較前欠佳。骨髓單個(gè)核細(xì)胞中線粒體ROS表達(dá)也出現(xiàn)同骨髓單個(gè)核細(xì)胞一樣的表現(xiàn),表明結(jié)果穩(wěn)定可靠。ROS既能誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生,又具有抗腫瘤性及參與細(xì)胞耐藥,ROS在細(xì)胞內(nèi)的水平可以通過(guò)SIRT3靶向多種底物以調(diào)節(jié)線粒體的代謝而調(diào)節(jié),那么可以通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT3的水平而降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性,使之可能成為潛在的治療靶點(diǎn),改善疾病的預(yù)后及治療療效。
復(fù)發(fā)、耐藥是AML患者治療效果差的主要原因[14]。本研究顯示在不同疾病狀態(tài)的AML患者中,SIRT3、IDH2及ROS表達(dá)水平相應(yīng)改變,解釋了AML患者耐藥的可能機(jī)制,但尚未明確SIRT3、IDH2及ROS之間的因果關(guān)系,后續(xù)可通過(guò)建立模型及進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證探明。
綜上所述,SIRT3在成人急性髓系白血病患者中表達(dá)下降,可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激以增加細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。SIRT3的異常表達(dá)可參與白血病細(xì)胞耐藥機(jī)制。研究SIRT3在急性髓系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的功能,可作為評(píng)估患者誘導(dǎo)治療及治療療效評(píng)估的指標(biāo)。有助于研究出更多具有針對(duì)性、特異性的治療藥物,改善預(yù)后,降低復(fù)發(fā)率。